Profondità di campo

La conseguenza dell’apertura numerica è che è direttamente correlata alla profondità di campo (DOF). Per un dato obiettivo, guardando un campione, c’è un particolare piano di fuoco perfetto. La profondità di campo è, quanto lontano sopra e sotto quel piano l’obiettivo e il campione possono essere e avere ancora tutto a fuoco.

La stessa cosa avviene nella fotografia tradizionale, un’apertura molto piccola aumenterà la profondità di campo. Un’apertura numerica più alta darà una risoluzione più alta, ma la profondità di campo diventa considerevolmente più piccola. C’è una distanza sopra il piano del campione e una distanza sotto il piano del campione, e ovunque all’interno di esse, c’è essenzialmente una messa a fuoco perfetta. Non appena l’obiettivo e il campione sono al di fuori di questo confine, l’immagine inizia a sfocarsi.

Questo è chiamato profondità di campo. La formula per la profondità di campo è:

dove:
“n” è l’indice di rifrazione del materiale tra l’obiettivo e il campione
λ (lambda) è la lunghezza d’onda della luce
NA è l’apertura numerica

Nella maggior parte dei casi il materiale tra l’obiettivo e il campione è aria, e “n” è uguale a 1.00. Per l’acqua, l’indice di rifrazione è 1,33, e l’olio da immersione specializzato per la microscopia è 1,52. Per un obiettivo a basso ingrandimento come un 4X o anche un 10X, la profondità di campo tipica è più o meno da 3 a 5 micron. In questo caso, se il campione è molto piatto, la messa a fuoco può non essere richiesta affatto, o è sufficiente una sola volta. In generale, i campioni variano in spessore e variano in planarità, quindi la messa a fuoco è necessaria.

Per un ingrandimento 20X, che può essere un’apertura numerica di 0,6 a 0,8, la profondità di campo scende a circa più o meno 500 nanometri. Passando all’alto ingrandimento con immersione in olio ad un’apertura numerica di 1,47, la profondità di campo scende molto drammaticamente, e la profondità di campo potrebbe essere più o meno 0,1 a 0,2 micron (100 – 200 nm). Questa è una tolleranza molto stretta. A 100 nanometri o 200 nanometri, piccolissimi cambiamenti nella planarità del campione o nell’altezza del campione, o la precisione delle guide dello stadio di movimento del campione XY, renderanno difficile rimanere a fuoco. Per mantenere la messa a fuoco in questa situazione, un sistema di autofocus laser a inseguimento continuo collegato a uno stadio di messa a fuoco per obiettivi ad alta larghezza di banda, come il DOF-5, è il modo ideale per mantenere la messa a fuoco in queste applicazioni ad alta apertura numerica e ad alta risoluzione.