Immaginate di voler piantare un giardino fiorito. Puoi cercare dei fiori che si adattino perfettamente al tuo ambiente, anche se possono essere costosi e richiedere cure esperte. Oppure potete scegliere varietà che forse non sono ideali, ma che crescono ovunque, sono convenienti e non hanno bisogno di molte cure. Allo stesso modo, quando stai iniziando un progetto di ricerca e devi decidere se usare cellule primarie umane o linee cellulari immortali, devi considerare una serie di fattori.
Vuoi costruire un modello di cultura cellulare che rappresenti da vicino la situazione umana in vivo? In questo caso, le cellule primarie umane sono una scelta migliore. Inoltre, se avete intenzione di pubblicare i vostri risultati, dovreste tenere a mente che i revisori potrebbero volere che convalidiate i vostri risultati in un sistema che sia rilevante per la fisiologia umana. Oppure volete un modello che sia facile da lavorare e ben consolidato? In questo caso, le linee cellulari immortali sarebbero preferite, anche se le cellule potrebbero non comportarsi esattamente come quelle umane.
Cellule primarie umane: sbirciare nella vita reale
Le cellule primarie umane sono isolate direttamente dai tessuti e conservano le caratteristiche morfologiche e funzionali del loro tessuto di origine. Per esempio, il tessuto tumorale originale del cancro colorettale conserva diversi marcatori tumorali e microRNA noti. In confronto, le linee cellulari mostrano differenze nella loro espressione (Pastor et al., 2010).
Le cellule primarie, tuttavia, non vivono per sempre. Subiscono processi di senescenza e hanno un potenziale limitato di autorinnovamento e differenziazione. Man mano che invecchiano, mostrano cambiamenti morfologici e funzionali, ed è per questo che dovreste usarle nei primi passaggi. Anche le caratteristiche genetiche e l’età dei donatori sono importanti, poiché le loro cellule possono comportarsi diversamente nelle stesse condizioni di coltura. Questo può essere una buona cosa quando si sta studiando come specifiche caratteristiche cellulari differiscono nella popolazione o quando si testano nuovi composti. D’altra parte, i vostri test richiedono una bassa varianza? Allora usate cellule dello stesso donatore. Un vantaggio delle cellule primarie umane è che non è necessario fare affidamento su modelli animali. Questo significa che puoi evitare le differenze interspecie – come l’anatomia, i percorsi molecolari e il metabolismo – che possono influenzare la tossicità dei farmaci e il modo di azione.
Come gestisci le cellule primarie determina il successo
Le colture di cellule primarie umane possono essere iniziate da cellule sane o da cellule tumorali. Provengono da donatori sani, donazioni di organi, campioni chirurgici, tessuti fetali o donatori post-mortem. Quando pianifichi i tuoi esperimenti, tieni presente che la fonte di cellule primarie umane è limitata. Questo significa che potreste non essere in grado di ottenere altro materiale dallo stesso donatore. Inoltre, le colture primarie derivate da espianti di tessuto sono un mix di cellule diverse in fasi diverse, quindi se si desidera avviare culture più omogenee, potrebbe essere necessario purificare specifici tipi di cellule. Poiché le cellule primarie sono più sensibili delle linee cellulari, spesso richiedono nutrienti e fattori di crescita aggiuntivi.
Perché diversi tipi di cellule hanno bisogno di mezzi diversi per crescere e sopravvivere, ottimizza sempre le condizioni di coltura per ogni tipo di cellula. Le linee cellulari hanno bisogno di alti livelli di siero. Tuttavia, il siero non è standardizzato e vari lotti possono mostrare un’alta variabilità delle molte sostanze contenute. Questo potrebbe influenzare notevolmente i risultati della tua ricerca e renderli addirittura incoerenti. Nel caso di cellule primarie umane, ricorda che alti livelli di antibiotici diminuiscono la loro vitalità e crescita. Quando le cellule raggiungono i diversi stadi di coltura, è necessario caratterizzarle e identificare qualsiasi cambiamento morfologico e funzionale. Questo è rilevante per il controllo di qualità. Naturalmente, una buona pratica di coltura cellulare richiede che tu documenti tutte le informazioni necessarie per tracciare i materiali e i metodi. In questo modo, ti assicuri che il tuo modello sia trasparente e riproducibile (Pamies et al., 2018).
Lotta alla contaminazione da endotossine nelle colture cellulari
La contaminazione minaccia gli studi sulle colture cellulari. Non solo batteri, funghi, lieviti e micoplasmi sono i colpevoli, anche le endotossine causano problemi. Influenzano la crescita e la funzione cellulare sia in vitro che in vivo (Ryan et al, 2018). Le endotossine sono lipopolisaccaridi derivati dalla membrana esterna della maggior parte dei batteri gram-negativi, che sono stabili anche ad alte temperature. Le endotossine contaminano spesso la vetreria da laboratorio, poiché mostrano un’elevata affinità per i materiali idrofobici come la plastica. Le fonti di contaminazione includono l’acqua usata per il lavaggio, i media e i sieri, gli additivi, la plastica da laboratorio e la vetreria. È possibile rilevare le endotossine con il test del lisato di amebociti di Limulus (LAL), in quanto il LAL forma gel-clots quantificabili in loro presenza.
I vari tipi di cellule reagiscono in modo diverso alla presenza di endotossine, e i limiti di endotossina dovrebbero essere stabiliti per ogni tipo di cellula nelle colture in vitro (Nomura et al., 2017). Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da endotossine, utilizzare supporti, sieri e strumenti di laboratorio certificati e non pirogeni, e controllare l’acqua utilizzata in laboratorio, soprattutto quando si lavora con cellule sensibili.
Linee cellulari: parte integrante della ricerca biologica
Lavorare con cellule primarie si basa su decenni di ricerca utilizzando linee cellulari. Dall’inizio del 20° secolo, le linee cellulari hanno fornito agli scienziati grandi intuizioni sui processi biologici delle cellule umane. Le linee cellulari immortali sono diventate un potente strumento per innumerevoli applicazioni, tra cui il test del metabolismo dei farmaci e della citotossicità, lo studio della funzione genica, così come la produzione di vaccini, anticorpi e composti biologici.
Come detto, lo scopo della tua ricerca determina il tipo di coltura cellulare che usi. I ricercatori che intendono studiare i processi biologici di base, manipolare le funzioni cellulari, stabilire nuovi metodi o eseguire screening preliminari tendono a scegliere linee cellulari immortalizzate. Perché? Sono convenienti, facili da lavorare e possono essere tenute in coltura per periodi di tempo più lunghi. Le linee cellulari sono anche facili da manipolare ed espandere. (Kaur et al., 2012). Lo screening ad alta produttività è all’ordine del giorno? Qui, la fornitura illimitata di materiale potrebbe anche essere un vantaggio.
Tuttavia, anche se i risultati sperimentali ottenuti con linee cellulari possono essere chiaramente interpretati e confrontati in modo coerente con studi precedenti, bisogna tenere presente che la rilevanza fisiologica di questi studi potrebbe non essere molto alta. Ci sono anche limiti a ciò che si può fare con le linee cellulari. Infatti, alcune mostrano solo una somiglianza marginale con le cellule primarie originali, poiché i passaggi seriali possono causare variazioni nel genotipo e nel fenotipo. Si potrebbe finire con un contenuto genomico alterato e un profilo di espressione anormale. Le linee cellulari mancano di caratteristiche morfologiche o funzionali chiave, quindi potrebbero non essere in grado di indurre biomarcatori rilevanti. Questo significa che i risultati ottenuti con le linee cellulari in laboratorio non possono essere completamente tradotti agli esseri umani. Per lunghi periodi di tempo, le linee cellulari immortali possono anche essere contaminate da altre cellule o microrganismi (vedi il post del blog: Mycoplasma Contamination – Small Organisms Cause Big Trouble). Quindi per favore seguite questo consiglio: Prima di fare qualsiasi lavoro con le linee cellulari, convalidatele sempre prima per assicurarvi che le vostre cellule non siano identificate erroneamente o contaminate (Lorsch et al, 2014).
In breve, basate la vostra scelta di cellule primarie umane o linee cellulari immortali sul vostro obiettivo di ricerca. In molti casi, le linee cellulari immortali offrono un modello molto prezioso per gli esperimenti preliminari. Poi usa cellule primarie umane per replicare i risultati chiave. Questo aumenta la traduzione e rende i vostri risultati più rilevanti per la fisiologia umana.