Proprietà e rilevamento della neurotossina botulinica
I clostridi producono più tipi di tossine proteiche di qualsiasi altro genere di microrganismi. La caratteristica principale del Clostridium botulinum è la sua capacità di sintetizzare una neurotossina di straordinaria potenza. I BoNT comprendono una famiglia di tossine farmacologicamente simili che si legano alle sinapsi colinergiche periferiche e bloccano l’esocitosi dell’acetilcolina alle giunzioni neuromuscolari. I BoNT sono prodotti negli alimenti, nell’intestino e in cultura come complessi di tossine progenitrici che consistono di neurotossina botulinica associata a proteine non tossiche. È stato dimostrato che i componenti non tossici dei complessi conferiscono stabilità alla neurotossina e prevengono l’inattivazione da parte degli enzimi digestivi nell’intestino.
La diagnosi di botulismo è generalmente effettuata tramite la valutazione dei sintomi clinici nei pazienti, e per i focolai di origine alimentare, sul raggruppamento di casi che coinvolgono un gruppo di persone che hanno mangiato un cibo comune. Nella maggior parte delle indagini sul botulismo, l’obiettivo primario è quello di rilevare la presenza di BoNT poiché le spore di C. botulinum sono diffuse nell’ambiente e contaminano molti alimenti. Il rilevamento di BoNT nel sangue, nel contenuto gastrico e nel cibo fornisce la conferma del botulismo. L’isolamento di C. botulinum da un alimento sospetto, dalle feci di neonati con sintomi di botulismo, o da ferite fornisce prove a sostegno della diagnosi di botulismo. Tuttavia, non fornisce una conferma nella maggior parte dei casi, poiché le spore si trovano negli alimenti e occasionalmente nelle feci di adulti sani.
BoNT è preferibilmente rilevato utilizzando un biotest della tossina estratta da un campione alimentare o clinico. L’estratto viene iniettato intraperitonealmente nei topi e gli animali vengono osservati periodicamente per i segni tipici del botulismo per un massimo di quattro giorni. A seconda della quantità di BoNT presente, i sintomi del botulismo sono generalmente osservati entro 4-24 ore. I sintomi caratteristici includono la diminuzione della mobilità degli animali, l’arruffamento del pelo, la difficoltà a respirare, la contrazione dei muscoli addominali che danno la morfologia della “vespa”, seguita da convulsioni e morte. Gli animali che mostrano questi segni di solito muoiono entro 24-48 ore. Gli animali che muoiono prima di 2 ore o dopo 48 ore dovrebbero essere considerati come vittime di sostanze diverse dal BoNT. La morte dovuta al BoNT è confermata dalla neutralizzazione con antitossine sierotipo-specifiche.
Sono spesso riscontrate complicazioni nel biotest sui topi del BoNT da campioni clinici e da alcuni alimenti. In particolare, sono comuni le morti causate da sostanze interferenti non botuliniche. Queste morti aspecifiche possono generalmente essere evitate diluendo la sostanza interferente letale fino ad un punto finale in cui la morte è causata dal BoNT più potente. Occasionalmente, più di un sierotipo di BoNT può essere presente in un campione da analizzare, e la conferma richiederebbe la neutralizzazione con una miscela di antitossine. Con gli alimenti o i campioni clinici, le morti non botuliniche possono verificarsi per infezione o per la presenza di endotossine. Gli agenti infettivi possono essere rimossi per filtrazione a membrana o per aggiunta di antibiotici all’estratto da testare. Gli estratti contenenti endotossine possono generalmente essere diluiti fino a un punto finale adeguato, o le endotossine possono essere rimosse per adsorbimento. Con estratti da ceppi non proteolitici di C. botulinum (gruppo II), la tossicità è aumentata dall’attivazione da parte di una proteasi come la tripsina. In alcuni alimenti, la tripsina può generare peptidi tossici e quindi la reazione dovrebbe essere terminata con l’aggiunta di un inibitore della tripsina di soia dopo 30-60 minuti.
Il C. botulinum può essere isolato dagli alimenti mediante arricchimento in un mezzo di crescita adatto come il brodo di carne cotta-glucosio o mezzi contenenti peptoni, estratto di lievito e glucosio. Il C. botulinum ha esigenze nutrizionali complesse e richiede un terreno ricco per la crescita. Per l’isolamento, è spesso utile riscaldare una porzione di cibo o di campione clinico a 80° o 60°C per selezionare le spore di C. botulinum di gruppo I e II, rispettivamente. Occasionalmente, l’etanolo al 50% viene utilizzato per inattivare le cellule vegetative nei campioni di cibo analizzati per il C. botulinum di gruppo II. Dopo l’arricchimento, la presenza di BoNT viene testata tramite biotest sui topi come descritto in precedenza. Agar di isolamento selettivo contenenti antibiotici tra cui cicloserina, sulfametoxazolo e trimetoprim, sono stati utilizzati per l’isolamento del C. botulinum di gruppo I da campioni clinici.
Una varietà di metodi immunologici sono stati sviluppati per il rilevamento del BoNT ma la maggior parte non sono sensibili come il biotest del topo e hanno anche il potenziale svantaggio di rilevare BoNT biologicamente inattivo. Sono stati fatti diversi progressi nei saggi immunoassorbenti legati ad un enzima (ELISA) per alleviare questi inconvenienti ed è probabile che l’ELISA sarà usato per integrare ma non sostituire il biotest del topo.