Abstract

Duloxetine è un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina e della norepinefrina di seconda generazione usato principalmente per il trattamento della depressione. Relativamente pochi incidenti mortali sono stati riportati in associazione con il suo uso. Allo stesso modo, non ci sono rapporti noti che forniscono un’analisi completa dei campioni di sangue, fluidi e tessuti in un contesto di overdose. Qui presentiamo un caso fatale di tossicità da duloxetina con la più alta concentrazione di sangue post mortem riportata e un’analisi tossicologica completa della duloxetina nel sangue femorale, nell’umor vitreo, nel tessuto epatico, nelle urine e nel contenuto gastrico. In questo modo, speriamo di fornire dati che possano aiutare sia i tossicologi che i patologi forensi a valutare la tossicità della duloxetina in futuro.

Introduzione

La duloxetina (Cymbalta®) è un potente e selettivo inibitore della ricaptazione della serotonina e della norepinefrina (SNRI), disponibile in capsule a rilascio ritardato. La sua designazione chimica è (+)-(S)-N-metil-γ-(1-naftilossi)-2-tiofenepropilammina cloridrato (1) (Figura 1). La formula empirica è C18H19NOS-HCl, che corrisponde a un peso molecolare di 333,88 g/mol (2).

Ha l’approvazione normativa per la gestione di una serie di condizioni del sistema nervoso centrale (CNS), anche come analgesico per il dolore neuropatico periferico diabetico, la fibromialgia e il dolore muscoloscheletrico cronico. Questo farmaco di seconda generazione è anche usato nel trattamento del disturbo depressivo maggiore, del disturbo d’ansia generalizzato e dell’incontinenza urinaria da stress nelle donne (1). Questo ambito d’uso in espansione insieme a diverse interazioni note tra farmaci da prescrizione può portare a nuove preoccupazioni nella tossicologia post-mortem. La duloxetina è stata associata alla tossicità della serotonina in combinazione con alcuni farmaci, ma ci sono ancora pochi casi noti di tossicità dovuta solo al sovradosaggio di duloxetina (3). Come gli altri SNRI di seconda generazione, la duloxetina ha meno effetti collaterali degli antidepressivi triciclici (TCA) e ha meno probabilità di provocare la morte in seguito a un’overdose (3). I sintomi da overdose di duloxetina possono includere sonnolenza, coma, sindrome da serotonina, convulsioni, sincope, tachicardia, ipotensione, ipertensione e vomito (2).

La duloxetina cloridrato è prescritta a dosi giornaliere di 60-120 mg con dosi per il trattamento di ansia e/o depressione che vanno tipicamente da 40 a 60 mg, una volta al giorno o in due dosi divise. La concentrazione plasmatica massima si verifica dopo 6 ore, e lo stato stazionario viene raggiunto entro 3 giorni. La duloxetina è altamente legata (>90%) alle proteine nel plasma umano, con un volume apparente di distribuzione medio di ∼1,640 L (1). Il metabolismo avviene prevalentemente nel fegato con biotrasformazione che coinvolge il sistema del citocromo P450 per l’80-90% attraverso gli isoenzimi CYP1A2 e CYP2D6 in numerosi metaboliti non attivi (4). La cinetica mostra una moda lineare entro i livelli di dosaggio raccomandati, oltre i quali la saturazione è evidente con un tasso cinetico non lineare. L’emivita media di eliminazione (t1/2) è di circa 12 h, che varia da 8 a 17 h negli studi clinici (4).

L’American Association of Poison Control Centers (AAPCC) ha riportato 3.428 casi di avvelenamento che coinvolgono duloxetina nel 2013 (5). Inoltre, riferiscono che i numeri di mortalità legati alla duloxetina sono aumentati da 1 caso nel 2004 a 14 nel 2007 (4). Nonostante questo fatto, in letteratura sono stati descritti relativamente pochi casi di tossicità fatale da duloxetina. In un rapporto dall’Australia, tra il 2009 e il 2012 ci sono stati 19 casi mortali da farmaci misti in cui era presente la duloxetina. La più alta concentrazione di duloxetina riportata nel sangue femorale in questa serie era di 1,42 mg/L (3). Anderson et al. hanno esaminato i livelli post mortem di duloxetina in 12 vittime con concentrazioni nel sangue periferico che andavano da 0,0 a 0,26 mg/L (6). Allo stesso modo, Vey e Kovelman hanno riportato sei decessi in cui è stata rilevata la duloxetina, con il più alto livello ematico centrale post mortem di 2,5 mg/L (4). Mentre questi rapporti isolati descrivono i livelli ematici, non ci sono dati noti sui livelli di duloxetina nei tessuti e nei fluidi corporei in caso di overdose/tossicità. Pertanto, riportiamo un caso di mortalità da droga mista in cui la duloxetina è stata misurata nel sangue femorale, nel liquido vitreo, nel tessuto epatico, nelle urine e nel contenuto gastrico.

Rapporto del caso

Una donna caucasica di 70 anni con una storia medica significativa per la malattia cardiaca valvolare con sostituzione della valvola a distanza, ipertensione, dolore cronico alla schiena con interventi chirurgici multipli e precedenti overdose di farmaci e abuso di alcol a distanza è stata trovata distesa sul pavimento nella sua residenza quando un vicino ha eseguito un controllo dello stato di benessere. Era sveglia, ma confusa, e si lamentava di avere la bocca asciutta e ha anche dichiarato di essere stata sul pavimento dalla mattina presto. Una bottiglia di vodka vuota è stata trovata vicino a lei, ed era incontinente di urina. Fu portata in un ospedale vicino dove fu trovata afebrile (37,2°C), normotesa (130/101 mmHg), tachicardica (104 battiti al minuto) e tachipnea (22 respiri al minuto). Le analisi iniziali hanno mostrato un elevato numero di globuli bianchi con livelli di azoto ureico nel sangue (BUN) e creatinina leggermente elevati e un’acidosi metabolica con gap anionico. Una radiografia del torace ha mostrato una sospetta polmonite del polmone destro e una TAC della testa non ha mostrato alcun trauma. Poco dopo il suo ritorno dagli esami radiologici, ha subito un arresto cardiopolmonare e non è stato possibile rianimarla con successo.

L’esame autoptico è stato eseguito il giorno seguente e ha mostrato una donna obesa del peso di 168 libbre e 61 pollici di altezza (BMI = 31,7 kg/m2) con evidenza di una precedente sostituzione bio-protesica della valvola aortica che non mostra vegetazioni grossolane o microscopiche. Nessun microrganismo è stato isolato dalle colture di sangue post-mortem. C’era una lieve aterosclerosi sistemica e ipertensione con un cuore allargato e dilatato (450 g). Il contenuto gastrico consisteva in 40 cc di liquido denso, marrone-giallo, senza oggetti estranei o pillole rilevabili. Non erano presenti lesioni, ad eccezione delle fratture anteriori delle costole legate alla rianimazione cardiopolmonare. Nessuna polmonite è stata vista grossolanamente o microscopicamente.

Un campione di sangue femorale di 50 mL è stato raccolto durante l’assunzione del corpo nell’ufficio del medico legale (∼3 ore dopo la morte) tramite un prelievo trans-cutaneo. Ulteriori campioni tossicologici prelevati durante l’esame autoptico (∼20 h dopo la morte) erano i seguenti: umore vitreo, contenuto gastrico, tessuto epatico e urine. Non è stato raccolto sangue centrale. I farmaci/contenitori raccolti dal personale medico di emergenza sulla scena sono elencati nella tabella I.

Sperimentale

Raccolta di campioni postraccolta di campioni post mortem

Il sangue femorale è stato raccolto ∼3 ore dopo la morte come descritto sopra. Vitreo, urina, fegato e contenuto gastrico sono stati raccolti al momento dell’autopsia ∼20 ore dopo la morte. Tutti i campioni sono stati refrigerati fino all’analisi.

Analisi tossicologica

Il sangue femorale post-mortem è stato analizzato per l’alcol e i composti volatili (GC-FID headspace), il monossido di carbonio (UV-Vis), il glicole etilenico (GC-MS), droghe d’abuso comuni tramite ELISA (anfetamina, barbiturici, benzodiazepine, cannabinoidi, cocaina/metaboliti, fentanil, metamfetamina, metadone, oppiacei, ossicodone/ossimorfone e fenciclidina) (Immunalysis Inc., Pomona, CA), uno screening standard della droga acido/neutro a seguito di un’estrazione liquido-liquido simile a quella pubblicata da Lo et al. (7) e uno screening standard della droga alcalina mediante GC-MS a seguito di un’estrazione liquido-liquido simile a quella pubblicata da Foerster e Mason (8). I risultati positivi sono stati confermati e quantificati da tecniche successive e specifiche.

Materiali

Solventi; il metanolo è stato ottenuto da EMD Chemicals (Germania), il grado OmniSolv è stato acquistato tramite VWR International (Randor, PA) e JT Baker tramite Fisher Scientific (Hampton, NH), l’acetonitrile (20%) in acqua da EMD (Germania) è stato ottenuto da Fisher Scientific (Hampton, NH), il cloruro di n-butile era da EMD Chemicals (Germania), il grado OmniSolv è stato acquistato tramite VWR International (Randor, PA), 80:20 acqua-acetonitrile, 5 mM bicarbonato di ammonio (Fluka) e 0.2% di acido acetico in acetonitrile (Sigma) sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO). L’idrossido di ammonio concentrato (NH4OH), l’acido cloridrico concentrato (HCl) e l’acido solforico 0,5 M (H2SO4) sono stati acquistati da JT Baker tramite Fisher Scientific (Hampton, NH) e l’HCL metanolico (1% v/v) è stato preparato in casa.

Calibratori/controllo positivi: la difenidramina è stata ottenuta da Cerilliant (Round Rock, TX). Controllo della difenidramina di seconda fonte ottenuto da Lipomed (Cambridge, MA), preparato in metanolo. Standard interno: difenidramina-d3 ottenuta da Cerilliant (Round Rock, TX), preparata in metanolo. Calibratori/controllo positivi: ciclobenzaprina ottenuta da Cerilliant (Round Rock, TX). Secondo controllo di origine ottenuto da Lipomed (Cambridge, MA), preparato in metanolo. Standard interno: ciclobenzaprina-d3 ottenuta da Toronto Research (North York, ON, Canada) in metanolo.

Metodi

Schermo alcalino della droga

Utilizzando la mepivacaina come standard interno e un’estrazione liquido-liquido modificata simile a quella pubblicata da Foerster e Mason (8), il campione del caso e i controlli corrispondenti sono stati analizzati utilizzando GC-MS in modalità full scan. La difenidramina, la ciclobenzaprina e la duloxetina sono state identificate in base al tempo di ritenzione relativo e agli spettri di massa a scansione completa.

L’identificazione presuntiva degli analiti in modalità MS a scansione completa comprende una corrispondenza del tempo di ritenzione (RRT) rispetto a uno standard di riferimento e una corrispondenza della libreria contenente almeno i tre ioni più abbondanti in proporzioni adeguate.

La difenidramina e la ciclobenzaprina sono state quantificate in-house. Il sangue femorale, il vitreo, il fegato, le urine e il gastrico sono stati inviati a NMS Laboratories per quantificare la duloxetina.

Analisi di quantificazione della difenidramina (GC-MS SIM)

La difenidramina è stata misurata utilizzando uno standard interno deuterato e una procedura di estrazione Foerster (8) modificata. I calibratori di Cerilliant (Round Rock, TX) e i controlli di Lipomed (Cambridge, MA) sono stati preparati in metanolo da standard di 1,0 mg/mL. La difenidramina-d3 è stata acquistata da Cerilliant (Round Rock, TX). L’analisi è stata eseguita con un gascromatografo Agilent Technologies 7890A e un MSD XL inerte Agilent Technologies 5975C. La colonna analitica era una HP-1 MS (15 m, 0,25 mm di diametro e 0,25 µm di spessore) con elio come gas di trasporto (0,9 mL/min). Il forno è stato programmato a una temperatura iniziale di 100°C per 1 min, con rampa di 20°C/min fino a 320°C. Gli ioni monitorati per la difenidramina erano 58,1 m/z (ione di quantificazione) e 73,0 m/z; per la difenidramina-d3 61 m/z (ione di quantificazione) e 76 m/z. Una calibrazione a sei punti è stata preparata dagli standard stock che vanno da 20 a 750 ng/mL con un controllo di 400 ng/mL.

Analisi di quantificazione della ciclobenzaprina (LC-MS-MS dynamic multiple reaction monitoring, DMRM)

La ciclobenzaprina è stata misurata utilizzando uno standard interno deuterato e una procedura di estrazione Foerster modificata (8). I calibratori di Cerilliant (Round Rock, TX) e i controlli di Lipomed (Cambridge, MA) sono stati preparati in metanolo da standard di 1,0 mg/mL. La ciclobenzaprina-d3 è stata acquistata da Toronto Research (North York, ON, Canada). L’analisi è stata eseguita mediante spettrometria di massa LC-tandem (MS-MS) costituita da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Agilent 6410 LC (Santa Clara, CA) operante in ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità positiva, e un sistema HPLC Agilent 1290 Infinity. La cromatografia è stata eseguita utilizzando una colonna Waters X-Bridge BEH Phenyl (2,1 × 50 mm × 2,5 µm) con eluizione a gradiente. Le fasi mobili consistevano di 5 mM bicarbonato di ammonio (pH 10) in acqua DI (fase mobile A) e 0,2% di acido acetico in LC-MS grado acetonitrile (fase mobile B). La velocità di flusso è di 0,6 mL/min. Il gradiente della fase mobile era 0,0-9,0 min, la fase mobile B aumentava dal 25 al 50%; 9,0-9,1 la fase mobile B aumentava al 75% e si manteneva isocratica fino a 10,5 min, seguita da un periodo di equilibrio post-iniezione di 2 minuti. Il volume di iniezione era di 4 µL e la temperatura della colonna è stata mantenuta a 55°C. Lo spettrometro di massa in modalità ESI è stato azionato con gas azoto nelle seguenti condizioni: temperatura, 350°C; portata del gas, 8 L/min; pressione del gas di nebulizzazione, 45 psi; tensione dell’interfaccia capillare, 1.500 V; delta EMV +20; la polarità era positiva. Gli ioni monitorati per la ciclobenzaprina erano 276,2 m/z > 84,1 m/z (ione di quantificazione), 276,2 m/z > 58,2 m/z e 276,2 m/z > 231,1; per la ciclobenzaprina-d3 279,2 m/z > 87,1 m/z (ione di quantificazione) e 279,2 m/z > 61,2 m/z. Una calibrazione a sei punti è stata preparata dagli standard stock che vanno da 20 a 1.500 ng/mL con tre livelli di controllo.

Analisi di quantificazione della duloxetina (LC-MS-MS) presso i laboratori NMS

La duloxetina è stata misurata utilizzando uno standard interno deuterato con precipitazione delle proteine mediante una soluzione di solfato di zinco. I calibratori e le soluzioni di controllo sono stati preparati in metanolo da standard da 1,0 mg/mL acquistati da Cerilliant (Round Rock, TX). La duloxetina-d4 è stata ottenuta da Eli Lilly & Co. Ltd. (Indianapolis, IN). L’analisi è stata eseguita da un Waters TQD Tandem Mass Spectrometer (Milford, MA) con un sistema LC Waters Acquity Ultra Performance. La colonna utilizzata era una Phenomenex Synergi Hydro-RP (2,0 × 50 mm, 2,5 µm) (Torrance, CA), con una cartuccia Thermo Aquasil C18, 2,1 × 10 mm, 5,0 µm pre-colonna di guardia (Bellefonte, PA). Gli ioni monitorati per la duloxetina-d4 erano 302,1 m/z > 46,9 m/z (ione di quantificazione) e 302,1 m/z > 158 m/z; e per la duloxetina 298 m/z > 43,8 m/z (quantificazione) e 298 m/z > 154 m/z. Una calibrazione a sei punti è stata preparata dalla soluzione standard stock che va da 3,0 a 300 ng/mL. La determinazione della duloxetina nelle urine, nell’omogenato di tessuto epatico, nel liquido del contenuto gastrico e nell’umor vitreo è stata eseguita utilizzando due livelli di aggiunta standard per ogni campione.

Risultati

Lo schermo alcalino della droga ha rivelato la presenza di difenidramina, ciclobenzaprina e duloxetina. La tabella II elenca i risultati quantitativi.

Discussione

La causa della morte in questo caso è stata determinata come una tossicità mista di duloxetina, ciclobenzaprina e difenidramina. La componente più significativa della tossicità proveniva dalla duloxetina. È interessante notare che la lamentela iniziale del deceduto di “bocca secca”, anche se non specifica, è stata descritta come un effetto collaterale della terapia con duloxetina (9), probabilmente attraverso i suoi effetti noradrenergici.

La duloxetina è un farmaco relativamente nuovo, e in letteratura esistono limitate segnalazioni di overdose e incidenti. In una revisione del 2010, Vey e Kovelman hanno fornito dati post-mortem su sei incidenti mortali che hanno coinvolto la duloxetina, da sola o in combinazione con altri farmaci (4). I livelli riportati in questi casi erano tutti ottenuti dal sangue centrale, con la più alta concentrazione di duloxetina (2,5 mg/L) meno della metà della concentrazione trovata nel sangue periferico nel caso attuale (6,1 mg/L). Il lavoro di Vey affronta anche la questione della ridistribuzione post-mortem e cita un rapporto duloxetina sangue centrale-femorale di 1,98 come ottenuto da Anderson et al. (6). Dato questo, è possibile che la concentrazione trovata nel nostro caso sia quasi sei volte maggiore del livello più alto riportato. Sfortunatamente, nessun campione di sangue centrale è stato raccolto per l’analisi nel caso attuale.

Nel presente caso, sono stati analizzati anche diversi altri fluidi e campioni di tessuto. Sebbene i campioni analizzati (tessuto epatico, contenuto gastrico, urina e umore vitreo) fossero simili a quelli esaminati nel lavoro del 2006 di Anderson, et al. (6), il nostro rapporto illustra le concentrazioni in vari tessuti in un contesto di overdose/tossicità. Al contrario, Anderson ha descritto 12 casi in cui la duloxetina è stata identificata in campioni post-mortem, e non “implicata come unica causa di morte”. Risultati simili sono stati riportati da Pilgrim et al. nel 2014 in una revisione della prevalenza di duloxetina nelle indagini medico-legali sulla morte (3). Essi riportano livelli di duloxetina in 34 decessi con sangue femorale post-mortem che vanno da 0,01 a 1,42 mg/L con una media di 0,14 mg/L. Diciannove di questi decessi sono stati attribuiti alla tossicità del farmaco, ma non specificamente alla duloxetina. In un case report di una fatalità legata alla duloxetina, un livello di urina di 670 µg/L (0,67 mg/L) è stato trovato in associazione con una concentrazione ematica post-mortem femorale di 910 µg/L (0,91 mg/L) (10). Con questi e il nostro rapporto attuale, la gamma di livelli terapeutici e tossici di duloxetina sta diventando sempre più definita.

Conclusione

Presentato qui è un caso di studio post-mortem con le più alte concentrazioni di duloxetina riportate fino ad oggi, in una varietà di campioni di origine. Questi risultati si correlano bene con l’alto volume di distribuzione che la duloxetina è nota per esibire. Nonostante l’ottenimento di livelli di duloxetina da numerose fonti, il complesso profilo farmaco-tossicologico della duloxetina rimane non completamente compreso. Con l’emergere di questo e altri casi post mortem, è probabile che la duloxetina sarà un fattore più significativo da considerare nello stabilire la causa della morte. Pertanto, sarà importante per il tossicologo e il patologo forense avere una migliore comprensione della gamma di livelli di duloxetina nel sangue e in altri campioni tossicologici.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono i seguenti individui per la loro assistenza tecnica nell’analisi di questi campioni: Amanda Cooke, Thanh Huynh, Anthony Rodriguez, Justin Spatafore, Jennifer Turri e Jackie Venarchick.