Abstract

Questo studio indaga il meccanismo alla base dell’effetto di miglioramento dello zinco sulla fertilità nei ratti obesi utilizzando la proteomica. Sono stati studiati gli effetti di tre diverse dosi di ZnSO4 sulla spermatogenesi e sui livelli ormonali. Spermatogenesi testicolare è stato osservato da colorazione HE. I livelli sierici di estrogeni e testosterone sono stati misurati mediante immunodosaggio a microparticelle chemiluminescenti. L’analisi proteomica dello sperma è stata eseguita mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa. Il database DAVID è stato utilizzato per eseguire l’analisi di arricchimento GO e l’analisi dei percorsi KEGG dei geni differenzialmente espressi, e il database online STRING è stato utilizzato per costruire una rete PPI. Il numero di spermatozoi, la motilità degli spermatozoi e gli ormoni del testosterone del gruppo di ratti trattati con ZnSO4 sono aumentati. ZnSO4 ha migliorato la struttura testicolare e le anomalie della spermatogenesi causate dall’obesità. L’analisi proteomica ha mostrato che c’erano 401 proteine differenzialmente espresse in un totale di 6 campioni di sperma del gruppo trattato con ZnSO4 e dei gruppi di obesità. Le proteine differenziate sono state inserite nel sito DAVID. Le 341 proteine identificate sono state poi classificate secondo le loro funzioni biologiche. L’analisi KEGG ha mostrato che le vie di segnalazione arricchite includevano glicolisi/gluconeogenesi, metabolismo del carbonio, ciclo del citrato, metabolismo degli acidi grassi e metabolismo del piruvato. Alcune proteine hanno mostrato di essere associate alle vie di degradazione di valina, leucina e isoleucina. L’analisi STRING ha ottenuto 36 proteine di nodo. L’analisi Cytoscape ha mostrato che queste proteine hanno partecipato principalmente a nove reti tra cui il processo metabolico, l’ossido-riduzione, la respirazione aerobica, lo splicing dell’RNA e la coniugazione del glutatione. ZnSO4 può migliorare la fertilità dei ratti maschi obesi regolando l’espressione delle proteine relative al metabolismo, infiammazione e maturazione dello sperma.

1. Introduzione

L’obesità è associata all’infertilità maschile. C’è una certa coerenza temporale tra l’aumento del tasso di infertilità maschile, la diminuzione della qualità dello sperma e l’aumento del tasso di obesità. L’obesità porta a cambiamenti patologici nell’ultrastruttura testicolare, e l’apoptosi delle cellule spermatogenetiche è significativamente aumentata. La diminuzione del numero di spermatozoi maturi può essere una delle ragioni che portano alla bassa capacità spermatogenica delle persone obese.

Ci sono disturbi del metabolismo degli oligoelementi nelle persone obese. Il livello disturbato del metabolismo degli oligoelementi nel corpo indurrà effetti corrispondenti sul metabolismo dei lipidi. Nel sistema riproduttivo maschile, gli ioni di zinco sono distribuiti principalmente nel testicolo, nell’epididimo, nella prostata e nello sperma. Lo zinco è un marcatore della funzione della prostata. Inoltre, regola la funzione dello sperma, agisce come cofattore per la maggior parte delle reazioni enzimatiche e aiuta a mantenere la motilità dello sperma. Lo zinco svolge anche un ruolo importante nello sviluppo testicolare e nella formazione degli spermatozoi. La carenza di zinco aumenta significativamente l’apoptosi delle cellule germinali nel testicolo del topo e provoca l’arresto della spermatogenesi e danni alla fecondazione. Gli studi hanno dimostrato che gli uomini obesi hanno 3,5 volte più probabilità di avere oligozoospermia rispetto agli uomini con peso normale. L’integrazione di zinco può ridurre il peso delle persone obese. Lo stato di glucosio nel sangue (glicemia a digiuno), i parametri lipidici nel sangue (colesterolo totale, livello di trigliceridi, colesterolo lipoproteico ad alta densità e colesterolo lipoproteico a bassa densità) e la pressione sanguigna sono migliorati dopo l’integrazione di zinco. La preparazione orale di zinco può migliorare il contenuto di zinco nel plasma seminale, promuovere la trasformazione della proteina nucleare dello sperma (cioè, da lisina ad arginina), e inibire la depolimerizzazione prematura del nucleo dello sperma. Può migliorare la motilità dello sperma e la qualità del seme dei pazienti infertili senza effetti collaterali evidenti. Tuttavia, l’applicazione della proteomica nella comprensione degli effetti del trattamento ZnSO4 sulle proteine dello sperma nell’obesità è ancora limitata e ulteriori esplorazioni sono necessarie.

In questo studio, gli effetti di tre diverse dosi di ZnSO4 sulla spermatogenesi e livelli ormonali di ratti obesi sono stati studiati. Il meccanismo alla base di questo effetto è stato ulteriormente analizzato dall’analisi proteomica.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali

I ratti Sprague Dawley di 7 settimane (peso 180-200 g) sono stati acquistati dal Centro di animali sperimentali della Hebei Medical University. Sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore in una stanza con aria controllata (temperatura, umidità, ) con libero accesso all’acqua e al cibo per animali. Tutte le procedure di sperimentazione animale sono stati approvati dal Comitato Etico dell’Istituto Hebei di pianificazione familiare Scienza e Tecnologia.

2.2. Creazione del modello di obesità, raggruppamento degli animali e campionamento

I ratti sono stati divisi a caso in due gruppi: gruppo di alimentazione normale (15 animali per gruppo) e gruppo di modello di obesità (30 animali per gruppo). Ogni gruppo è stato alimentato con le diete corrispondenti per 8 settimane, cioè una dieta normale per il gruppo normale e una dieta ad alto contenuto di grassi per il gruppo modello di obesità. I pesi corporei dei ratti sono stati pesati settimanalmente e registrati per 8 settimane. Il modello di obesità è stato considerato riuscito quando il peso corporeo medio del gruppo modello era 1,2 volte quello del gruppo di controllo. La lunghezza dei ratti è stata misurata (dalla punta del naso all’ano), e l’indice Lee è stato calcolato dalla formula.

Dopo l’istituzione del modello di obesità, i ratti modello sono stati divisi a caso in due gruppi: il gruppo obesità e il gruppo trattato con ZnSO4. I ratti del gruppo trattato con ZnSO4 hanno ricevuto ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) per 4 settimane per via orale. Alla fine dell’esperimento, sono stati misurati il peso corporeo, il peso testicolare, il peso epididimale e il grasso peritesticolare di ogni gruppo, e il sangue è stato prelevato dall’aorta addominale. I campioni di sperma sono stati raccolti dall’epididimo caudale. I testicoli sono stati rimossi.

2.3. Conteggio degli spermatozoi e motilità degli spermatozoi

L’epididimo sinistro di ogni ratto è stato raccolto immediatamente dopo il sacrificio ed è stato trasferito in una provetta contenente 1 mL di soluzione salina calda (37°C). Sono stati poi agitati a 37°C per 5 minuti per permettere la dispersione degli spermatozoi. Circa 10 μL di sospensione spermatica diluita sono stati trasferiti in ogni camera di conteggio dell’emocitometro per determinare la concentrazione e la motilità dello sperma. La motilità è stata misurata come la percentuale di spermatozoi mobili (grado a+b) sul totale degli spermatozoi.

2.4. Determinazione del glucosio nel siero a digiuno, dei lipidi nel sangue e dell’insulina

I livelli di colesterolo totale, trigliceridi, lipoproteine a bassa densità e lipoproteine ad alta densità nel siero sono stati misurati su un analizzatore Siemens Centaur XP con un kit di immunodosaggio a microparticelle chemiluminescenti (Medical System Biotechnology Co., LTD). Il glucosio nel siero a digiuno è stato misurato con un kit di rilevamento del glucosio (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Cina) su un analizzatore ACCUTE TBA-40FR (Toshiba Medical Systems Co., Tokyo, Giappone). I livelli sierici di insulina sono stati determinati mediante test immunologico a chemiluminescenza su un sistema UniCel DxI 800 (Beckman Coulter, CA, USA) con reagenti corrispondenti (Beckman Coulter, CA, USA).

2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Il livello di leptina è stato determinato da kit ELISA (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, Cina). Dopo la fine della reazione, l’assorbanza è stata letta a 450 nm.

2.6. Colorazione HE

I testicoli sono stati fissati in soluzione di Bouin per una notte. I testicoli sono stati poi disidratati con alcool e inseriti in paraffina. I campioni sono stati sezionati a 5 μm di spessore e colorati con colorazione HE. La spermatogenesi testicolare è stata osservata al microscopio ottico.

2.7. Misurazione degli ormoni androgeni

I livelli di estrogeno e testosterone nel siero sono stati misurati su un analizzatore Siemens Centaur XP mediante un test immunologico con microparticelle chemiluminescenti. Il kit di rilevamento è stato acquistato da Siemens Healthcare Diagnostic Inc. e Cayman Chemical, Michigan, USA.

2.8. Cromatografia liquida-spettrometria di massa

I campioni di proteine dello sperma utilizzati in questo studio provenivano dai tre gruppi (gruppo normale, gruppo modello obesità e gruppo trattato con ZnSO4). I campioni di sperma sono stati raccolti dall’epididimo caudale. Brevemente, le proteine sono state estratte con un tampone lisato con 8 M urea, 10 mM DTT, e inibitore della proteasi. La sonicazione è stata eseguita per 3-5 minuti. Il surnatante è stato raccolto dopo una centrifugazione a 20000 g per 10 minuti a 4°C, e le proteine sono state quantificate con il metodo Bradford. Le proteine estratte sono state incubate con 100 mM TEAB a 100 μL e poi con 200 mM TCEP a 55°C per 1 h. Dopo di che, sono stati aggiunti 5 μL di 375 mM iodoacetamide (IAA). Dopo l’incubazione al buio per 30 min, è stato aggiunto acetone preraffreddato ed è stato incubato una notte a -20°C. Il surnatante è stato rimosso accuratamente dopo una centrifugazione a 8000 g a 10°C per 10 min, e il lisato è stato lasciato a temperatura ambiente per 2-3 min per asciugare. Infine, 100 μg di proteina, 100 μL di soluzione TEAB 100 mM, e l’enzima tripsina rapporto proteina (1 : 50) sono stati mescolati insieme e la digestione enzimatica è stata eseguita durante la notte a 37°C.

Cromatografia liquida-spettrometria di massa: campioni parzialmente digeriti sono stati presi e sciolti nella soluzione A (2% ACN/98% H2O/0.1% FA). Dopo la centrifugazione a 20000 g per 30 minuti, il surnatante è stato prelevato e la sequenza proteica è stata rilevata dallo spettrometro di massa EASY-nLC liquid phase-Q Exactive (American Thermo Fisher).

Le condizioni della spettrometria di massa erano 90 min per il tempo di acquisizione dei dati, 2 kV per la tensione di spruzzo, 320°C per la temperatura del capillare, 27% per l’energia di collisione normalizzata, e 300-1400 Da per la gamma di massa di raccolta. I parametri primari erano 70000 per la risoluzione, 36 per il target AGC, 60 ms per il massimo IT e il profilo per il tipo di dati dello spettro. I parametri secondari erano 17500 per la risoluzione, 54 per il target AGC, 80 ms per il massimo IT, e 3.0 m/z per la finestra di isolamento.

2.9. Data Retrieval

Nel motore di ricerca MaxQuant 1.5.2.8, il primo errore è 20 ppm, il secondo errore è 0.02 Da. La modifica fissa è la seguente. La cisteina è modificata in Carbamidomethyl-Cys, e la modifica variabile è la seguente: Ossidazione-M, digestione LysisC o Trypsin, o Glu-C. La digestione enzimatica permette fino a 2 siti mancanti. Il riempimento delle lacune dei dati, la normalizzazione e lo screening delle differenze () sono stati tutti eseguiti utilizzando le impostazioni standard del software Perseus. Un totale di 1344 proteine sono state identificate e quantificate in 6 campioni di entrambi i gruppi. Sono state ottenute informazioni qualitative e quantitative del gruppo Zn e G sulle proteine differenziali. Il software Perseus ha eseguito il test e l’analisi di significatività sui risultati quantitativi e sui rapporti delle proteine. L’elenco delle proteine differenziali ottenuto è il seguente: un totale di 401 proteine differenziali significative sono state ottenute dai risultati del -test e dall’analisi della distribuzione differenziale.

2.10. Analisi GO (Gene Ontology) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)

Le proteine differenziali sono state importate nel sito DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) (https://david.ncifcrf.gov/) per l’estrazione bioinformatica di base. Gli strumenti web forniti da DAVID sono stati utilizzati per cercare i termini di annotazione funzionale e i percorsi che erano arricchiti nelle proteine sopra identificate, tra cui componente cellulare, funzione molecolare e processo biologico.

2.11. Analisi della rete di interazione proteica

Le proteine differenziali selezionate sono state importate nel database online STRING (https://string-db.org/) per l’analisi. La mappa della rete di interazione genica differenziale è stata disegnata. I dati della rete interattiva sono stati esportati nel software Cytoscape 3.2 per determinare la proteina del nodo centrale della rete.

2.12. Analisi statistica

I dati sono stati visualizzati come . L’analisi statistica è stata eseguita in SPSS22.0 utilizzando l’analisi della varianza (ANOVA) a una via con un valore < 0,05 considerato statisticamente significativo.

3. Risultati

3.1. Rispetto al gruppo di controllo, il peso corporeo, il grasso peritesticolare, l’indice di Lee, i colesteroli totali, i trigliceridi, le lipoproteine ad alta densità e la leptina dei ratti del gruppo obesità e la leptina dei ratti del gruppo trattato con ZnSO4 sono aumentati significativamente. Rispetto al gruppo di controllo, la lipoproteina a bassa densità dei ratti del gruppo obesità è diminuita significativamente. Rispetto al gruppo obesità, il peso corporeo, il grasso peritesticolare e l’indice di Lee sono diminuiti nel gruppo trattato con ZnSO4, e la differenza era statisticamente significativa (Tabella 1). Al fine di rilevare gli effetti di ZnSO4 sulla fertilità dei ratti, ogni gruppo di parametri seminali è stato prima valutato secondo i criteri OMS 2010. Il numero di spermatozoi e la motilità degli spermatozoi sono stati inibiti nel gruppo obesità, come mostrato nella tabella 2. Rispetto al gruppo obesità, il numero di spermatozoi e la motilità dello sperma dei ratti trattati con ZnSO4 sono aumentati, suggerendo che ZnSO4 migliora i parametri dello sperma nei ratti obesi. L’obesità stessa può causare un aumento dei lipidi nel sangue, ma i nostri risultati hanno mostrato che la glicemia, i lipidi nel sangue e i livelli di insulina non hanno raggiunto il livello del diabete. Si può considerare che i fattori di confondimento delle complicazioni diabetiche sono stati esclusi. Inoltre, abbiamo rilevato il livello di testosterone nel siero. I risultati hanno mostrato che gli ormoni testosterone sono aumentati nel gruppo trattato con ZnSO4 rispetto al gruppo obesità (Tabella 2). Quindi, il trattamento con ZnSO4 potrebbe migliorare la qualità dello sperma dei ratti obesi.

Normale Obesità ZnSO4-trattato Peso corporeo (g) # Peso testicolare (g) Peso epididimale (g) grasso peritesticolare (g) # Lunghezza del corpo (cm) L’indice di Lee # Colesterolo totale (mmol/L) # Trigliceridi (mmol/L) # Liquidi ad altalipoproteine ad alta densità (mmol/L) # Bassa(mmol/L) # Glicemia sierica a digiuno (mmol/L) Insulina (mU/L) Leptina (pg/mL) # #

Nota: # rispetto al controllo normale; rispetto all’obesità.

Tabella 1

Confronto dei gruppi normali, obesità e ZnSO4-trattato nei dati di base.

Normale Obesità ZnSO4-trattato Concentrazione di sperma (per mL) # Motilità dello sperma (a+b%) # Testosterone (ng/mL) Estrogeno (pg/mL)

Nota: rispetto al controllo normale; rispetto all’obesità.

Tabella 2

Parametri dello Semen e livelli di ormone testosterone dei gruppi normali, obesità e trattati con ZnSO4.

3.2. Il trattamento con ZnSO4 migliora il recupero della compromissione testicolare indotta dall’obesità

Di conseguenza, abbiamo condotto l’analisi istologica del tessuto testicolare e i risultati sono stati mostrati nella Figura 1. Secondo l’istologia del testicolo, il gruppo normale ha mostrato una spermatogenesi normale (Figure 1(a) e 1(d)), mentre il gruppo dell’obesità ha mostrato una spermatogenesi interrotta poiché il lume del tubulo seminifero era quasi vuoto (Figure 1(b) e 1(e)). Come ci aspettavamo, il gruppo trattato con ZnSO4 ha mostrato un miglioramento significativo rispetto al gruppo obesità nell’istologia del testicolo con la comparsa di cellule di Sertoli e Leydig normali e spermatogenesi non interrotta (Figure 1(c) e 1(f)). Così, ZnSO4 può migliorare la struttura testicolare e le anomalie della spermatogenesi causate dall’obesità.

Figura 1

Morfologia trasversale dei testicoli per ogni gruppo con ingrandimento (a-c) 40x e (d-f) 100x mediante colorazione HE: (a, d) gruppo normale, (b, e) gruppo obesità e (c, f) gruppo trattato con ZnSO4.

3.3. Classificazione di 341 proteine dello sperma dalla bioinformatica: Componente cellulare, funzione molecolare e processo biologico

Per determinare le proteine differenzialmente espresse, è stata eseguita l’analisi proteomica. Un totale di 1344 proteine sono state identificate e quantificate in un totale di 6 campioni di sperma del gruppo trattato con ZnSO4 e del gruppo obesità. Il software Perseus ha eseguito il test e l’analisi di significatività differenziale sui risultati quantitativi e sui rapporti delle proteine. Un totale di 401 proteine significative sono state ottenute. Le proteine differenziali sono state inserite nel sito DAVID per il gruppo trattato con ZnSO4 e le differenze del gruppo obesità nella funzione delle proteine. Nella classificazione GO, 371 proteine sono state analizzate, e 30 proteine non corrispondevano. Le 341 proteine identificate sono state poi classificate secondo le loro funzioni biologiche. Abbiamo usato gli strumenti web forniti da DAVID per cercare i termini di annotazione funzionale e i percorsi che erano arricchiti nelle proteine sopra identificate. I risultati di queste analisi sono stati mostrati nella figura 2. Ci siamo concentrati sull’ontologia di componente cellulare, funzione molecolare e processo biologico per l’analisi di arricchimento dei termini di annotazione funzionale con e .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 2

Classificazione funzionale e arricchimento delle proteine identificate nello sperma. Analisi di classificazione delle funzioni GO del totale delle proteine identificate nello sperma secondo il loro (a) componente cellulare, (b) funzione molecolare e (c) processo biologico. (d) KEGG pathway enrichment analysis del totale delle proteine identificate nello sperma.

Nel gruppo “componente cellulare” (Figura 2(a)), l’analisi delle categorie ha mostrato che il 59% delle proteine con differenze significative erano componenti di organelli, e il 60,7% di quelle erano costituenti di organelli. Inoltre, il 29,6% delle proteine apparteneva a un complesso macromolecolare. L’analisi dei termini GO “funzione molecolare” ha rivelato che il 22% delle proteine sono state classificate come proteine con attività catalitica (Figura 2(b)). Le altre proteine potevano essere classificate come leganti di proteine, leganti di rRNA e leganti di enzimi. Per quanto riguarda il database “processo biologico” (Figura 2(c)), la maggior parte delle proteine del 24% erano associate al processo metabolico. Inoltre, le proteine erano collegate con il trasporto, la trasduzione del segnale, la morte cellulare, l’adesione cellulare, il processo del sistema immunitario e la riproduzione. I risultati dell’analisi del percorso del segnale (Figura 2(d)) con proteine concentrate e arricchimento sono i seguenti. Molteplici vie metaboliche come la glicolisi/gluconeogenesi, il metabolismo del carbonio, il ciclo del citrato (ciclo TCA), il metabolismo degli acidi grassi e il metabolismo del piruvato sono stati disturbati e colpiti, e alcune proteine hanno dimostrato di essere associate alle vie di degradazione della valina, leucina e isoleucina.

3.4. Gli effetti dello zinco sono ulteriormente identificati dalle proteine dello sperma differenzialmente espresse

L’analisi di quantificazione è stata eseguita per confrontare i livelli di proteine tra i tre gruppi. Nelle proteine differenziali, abbiamo selezionato proteine metaboliche, proteine associate al trasporto di zinco e proteine nodo della rete (Tabella 3). Le proteine con cambiamenti statisticamente significativi sono state mostrate nella Figura 3. Queste proteine erano ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR e TM165. Rispetto al gruppo obesità, l’espressione di ARG2, COX5B e ZNT1 nel gruppo trattato con ZnSO4 era significativamente diminuita, mentre l’espressione di LYAR e TM165 era significativamente aumentata.

Tabella 3

Nodi della rete di interazione delle proteine STRING.

Figura 3

L’analisi di quantificazione ha mostrato sei proteine significativamente espresse. Queste proteine includono ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR e TM165. # rispetto al controllo normale; rispetto all’obesità.

3.5. La rete di interazione proteica differenziale è stabilita usando il database della rete STRING

STRING è un software di analisi online che analizza e predice l’interazione tra proteine note. Il software STRING stabilisce un meccanismo di punteggio per fare pesi corrispondenti su diverse fonti di dati e infine dà un punteggio globale e poi costruisce una mappa di rete di interazioni proteina-proteina. Le 341 proteine differenziali selezionate sono state importate nel database online STRING (http://string-db.org/) per l’analisi, e 341 proteine sono state identificate, ed è stata generata la mappa di rete di interazione genica differenziale. Dopo di che, i dati della rete interattiva sono stati esportati nel software Cytoscape 3.2 per determinare la proteina del nodo centrale della rete. Si può vedere che la rete di composizione proteica differenziale è complessa (Figura 4). Abbiamo poi usato il plugin Cytoscape per analizzare le proteine nodo nella rete, e un totale di 36 proteine nodo sono stati ottenuti dall’analisi (Tabella 3). Da un elenco di reti top generato utilizzando STRING, abbiamo selezionato le sottoreti. L’analisi Cytoscape ha mostrato che queste proteine partecipavano principalmente a nove reti tra cui il processo metabolico, l’ossido-riduzione, la respirazione aerobica, lo splicing dell’RNA e la coniugazione del glutatione.

Figura 4

STRING rete di interazione proteica. Il cerchio rappresenta il gene e la linea rappresenta la relazione tra i geni.

4. Discussione

L’OMS definisce una persona con accumulo di grasso anormale o eccessivo come sovrappeso o obeso, e questo stato costituisce una minaccia crescente per la salute delle persone a livello globale. Alcuni rapporti mostrano che il tasso di obesità sta aumentando rapidamente, il che non solo aumenta il rischio di malattie, ma parallelamente aumenta anche il rischio dei pazienti di sviluppare disturbi riproduttivi. Poiché la funzione riproduttiva degli uomini si deteriora a livello globale, sempre più persone si sono rese conto che l’obesità diminuisce la qualità dello sperma. Con l’aumento del BMI, i parametri seminali vengono modificati, cambiando così la struttura fisica e molecolare degli spermatozoi. Studi precedenti hanno scoperto che la concentrazione di spermatozoi e il numero totale di spermatozoi mobili sono stati influenzati negativamente da un alto BMI. Nel presente studio, i ratti nei gruppi di obesità hanno mostrato una significativa diminuzione della concentrazione spermatica e della motilità degli spermatozoi rispetto a quelli del gruppo di peso normale, mentre ZnSO4 ha migliorato i parametri dello sperma rispetto al gruppo di obesità.

Gli squilibri negli ormoni sessuali possono influenzare la riproduzione maschile, e uno stato di sovrappeso può influenzare i livelli ormonali negli uomini. Allo stesso tempo, gli studi hanno dimostrato che l’obesità è strettamente legata a disturbi endocrini, come le anomalie degli ormoni sessuali. L’obesità negli uomini ha un impatto negativo sul potenziale riproduttivo maschile a causa dei cambiamenti nei livelli ormonali. Pertanto, abbiamo testato i livelli di siero in ogni gruppo. Gli ormoni del testosterone sono aumentati nel gruppo trattato con ZnSO4 rispetto ai gruppi normale e obesità. Sembra che il trattamento con ZnSO4 abbia aumentato significativamente i livelli di ormoni androgeni fino a raggiungere il livello del gruppo di controllo normale. La riduzione del peso corporeo e del livello di lipidi nel sangue nei ratti trattati con ZnSO4 può riparare le cellule di Leydig, aumentando così il livello di testosterone. Di conseguenza, un sistema riproduttivo maschile funzionale può essere rigenerato, assistendo la spermatogenesi e la rigenerazione della struttura testicolare. Evidentemente, l’istologia del testicolo del gruppo trattato con ZnSO4 è stata migliorata con le cellule di Sertoli e Leydig rigenerate e lo sperma nel lume ripristinato. Pertanto, una proteomica comparativa su larga scala fornisce un approccio efficace per identificare qualsiasi differenza di espressione proteica tra l’obesità e i gruppi trattati con ZnSO4. Il nostro studio ha identificato le differenze nei profili di espressione proteica tra lo sperma fertile normale e lo sperma dei gruppi trattati con ZnSO4.

L’analisi di annotazione diGO ha mostrato che il 24% delle proteine erano associate al processo metabolico e il 22% delle proteine erano classificate come proteine con attività catalitica. Le altre proteine sono state classificate come leganti di proteine, leganti di rRNA e leganti di enzimi, compreso il legame di ATP. È noto che le proteine che legano l’ATP svolgono un ruolo fondamentale nei processi biologici, il che indica cambiamenti nei processi sintetici e metabolici. I mitocondri sono organelli che forniscono energia (ATP) alle cellule. I mitocondri sono anche il bersaglio principale dello stress ossidativo. Nel corpo maschile, i mitocondri sono la principale centrale energetica nel processo di maturazione delle cellule spermatogeniche e forniscono anche energia agli spermatozoi dopo l’eiaculazione. Pertanto, quando lo stress ossidativo si verifica negli uomini obesi, i mitocondri nello sperma possono essere notevolmente danneggiati. Lo sperma è suscettibile allo stress ossidativo e non ha la capacità di riparare i danni. La dieta ad alto contenuto di grassi induce lo stress ossidativo nei ratti obesi, che induce danni alla membrana mitocondriale dello sperma e colpisce la funzione mitocondriale. Egwurugwu et al. hanno concluso che il solfato di zinco ha alcuni effetti positivi significativi sugli androgeni e sulla qualità dello sperma a dosi fisiologiche. Tuttavia, era dannoso a dosi più elevate.

ARG2 è noto per localizzare nei mitocondri. Gioca anche un ruolo cruciale nella produzione di ornitina, che è un precursore di prolina, idrossiprolina e poliammina, ed è essenziale per la proliferazione cellulare. L’obesità e le malattie ad essa associate sono caratterizzate da bassi livelli di infiammazione cronica. ARG2 promuove risposte proinfiammatorie nei macrofagi e contribuisce all’evidenza dell’aterosclerosi e della resistenza all’insulina legata all’obesità. Riteniamo che l’obesità precoce può portare alla upregulation di arginasi, con conseguenti cambiamenti sistemici in arginasi e metaboliti dell’arginina. L’aumento di ARG2 nel gruppo obeso può essere associato alla proliferazione cellulare e all’infiammazione cronica causata dall’obesità. L’arginasi migliora le anomalie lipidiche epatiche e sistemiche indotte dall’obesità inibendo l’attivazione delle vie coinvolte nel metabolismo dei trigliceridi epatici e nella funzione mitocondriale.

Di queste proteine, COX5B è particolarmente interessante e legata alla funzione mitocondriale e alla produzione di energia cellulare. Il citocromo ossidasi (COX, Complesso IV) è un enzima mitocondriale della catena di trasporto degli elettroni che risiede nella membrana interna mitocondriale, e la sua attività è necessaria per generare la forza motrice protonica che guida la sintesi di ATP a valle. È una delle tre isoforme mitocondriali della citocromo ossidasi, cioè il Complesso IV della catena respiratoria mitocondriale. COX5B è coinvolta nella fase finale della fosforilazione ossidativa, con la produzione di H2O, e il mantenimento del gradiente elettrochimico necessario per produrre ATP. Così, ridotti livelli di ARG2 e COX5B nei ratti trattati con solfato di zinco può suggerire un effetto indotto da zinco sulla fertilità nei ratti obesi, soprattutto nella rigenerazione testicolare, spermatogenesi e motilità dello sperma.

Alcune proteine differenzialmente espresse identificati in questo studio sono coinvolti nel processo di trasporto di zinco. Per esempio, Elgazar et al. hanno scoperto che ZnT1 è presente nella membrana plasmatica e nel citoplasma delle cellule di supporto. Gli studi hanno dimostrato che Znt1 svolge un ruolo importante nell’omeostasi dello zinco nei topi adulti. Il fattore di trascrizione metallo-responsivo-1 (MTF-1) svolge un ruolo nel coordinamento delle risposte cellulari all’omeostasi del metallo e allo stress ossidativo. MTF-1 è un fattore di trascrizione zinco-dipendente che stimola la metallotioneina e zinco trasportatore-1 (ZNT-1) geni con l’aumento della concentrazione di zinco. Foster et al. hanno dimostrato che l’espressione relativa dell’mRNA del trasportatore di zinco è molto variabile. ZnT1 è il più abbondante nel testicolo, e ha interazioni nel trasporto di zinco attraverso la membrana plasmatica. Noh et al. hanno riferito che i livelli di mRNA di ZnT1 erano leggermente elevati nelle donne obese, e i cambiamenti del trasportatore di zinco possono anche essere associati agli stati infiammatori legati all’obesità.

Il Ly1 antibody reactive homolog (LYAR) è stato descritto per la prima volta da Su et al. come un cDNA che codifica la proteina zinc finger isolata dalla linea di leucemia a cellule T del topo. Il gene Lyar, che è noto per essere espresso abbondantemente nel testicolo, codifica una proteina nucleolare che contiene un motivo C2HC zinc finger di tipo LYAR e tre segnali di localizzazione nucleare. Lee et al. hanno trovato che la proteina LYAR era presente negli spermatociti e negli spermatidi, ma non nello sperma. Tuttavia, abbiamo rilevato l’espressione di LYAR nello sperma, e la sua espressione è diminuita nello sperma di ratti obesi ed è aumentata nei gruppi trattati con ZnSO4. LYAR è identificato per essere associato ai ribosomi citoplasmatici nelle cellule germinali e tumorali maschili ed è coinvolto nell’elaborazione dell’RNA preribosomiale all’interno del nucleo. LYAR è un modulatore di una delle due fasi fondamentali dell’iniziazione della traduzione nelle cellule germinali maschili dei mammiferi e in alcuni tipi di tumori. LYAR sopprime notevolmente la trascrizione dei geni dello stress ossidativo, compresi SLC7A11, HMOX1 e CHAC1. L’oncoproteina Myc upregola l’espressione di LYAR attivando la trascrizione del suo gene, e l’upregolazione di LYAR, a sua volta, protegge le cellule tumorali dall’apoptosi mediata dallo stress ossidativo attraverso la riduzione dell’espressione del gene CHAC1.

La proteina transmembrana 165 (TM165) è una proteina transmembrana del Golgi, e la sua carenza causa un disturbo congenito della glicosilazione. TM165 è sia trascrizionalmente che traslazionalmente sovraespressa nel carcinoma epatocellulare e associata alla capacità invasiva del carcinoma epatocellulare. Tuttavia, i dati ottenuti in studi recenti danno diverse indicazioni sulla loro implicazione nell’omeostasi del calcio e del manganese. TM165 fornisce Ca2+ e Mn2+ al complesso del Golgi in cambio di H+ per sostenere le funzioni della lattosio sintasi e potenzialmente di altre glicosiltransferasi. La proteina umana TM165 del Golgi può trasportare calcio e manganese in cellule di lievito e batteri. Il nostro studio ha trovato che l’espressione TM165 in ratti obesi diminuito e aumentato dopo l’integrazione di zinco, suggerendo che TM165 aumentato dopo l’integrazione di zinco.

5. Conclusioni

In conclusione, i risultati di questo studio forniscono la prova che ZnSO4 può migliorare i livelli ormonali, la rigenerazione testicolare e la fertilità. L’analisi proteomica mostra inoltre che ZnSO4 può migliorare la fertilità dei ratti maschi obesi regolando l’espressione delle proteine relative al metabolismo, infiammazione, maturazione dello sperma e altre interazioni.

Data Availability

I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili su richiesta.

Disclosure

L’agenzia di finanziamento non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, raccolta e analisi dei dati, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non c’è alcun conflitto di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dal governo provinciale di Hebei finanziato Clinical Medicine Excellent Talents Training and Basic Research Project (Grant No. 20170183).

Cluster Score () Nodi Edges Nodo 1 5.2 11 26 IDH3B, PMPCB, IDH3A, ATP5O, ATP5H, COX5B, ACADM, ACLY, LIPE, CPT1B, CPT1A IDS 2 5 5 10 HNRNPF, PRPF19, HNRNPU, HNRNPM, SRSF2 3 4 4 5 GSTM2, GSTM4, GSTM1, MGST 4 4 4 6 QSOX1, APLP2, NUCB1, LAMBB2 5 3.333 4 5 ADAM2, EQTN, ACR, PRM2 6 3 3 3 3 ANXA5, HPRT1, GGT1 7 3 3 3 3 ARF5, ASAP1, ARF2 8 3 3 3 SEC13, PAFAH1B1, XP01