Abstract
Abbiamo esaminato gli effetti del trattamento con solfato di vanadio (VOSO4) a 5 e 10 mg/kg per 30 giorni sull’attività del pancreas endocrino e l’istologia nei ratti diabetici non diabetici e indotti da STZ. Nel gruppo diabetico, i livelli di glucosio nel sangue sono aumentati significativamente mentre il livello di insulinemia è diminuito notevolmente. Alla fine del trattamento, VOSO4 alla dose di 10 mg/Kg ha normalizzato il livello di glucosio nel sangue nel gruppo diabetico, ripristinato l’insulinemia e migliorato significativamente la sensibilità all’insulina. VOSO4 ha anche aumentato in modo dose-dipendente il numero di cellule beta immunopositive all’insulina nelle isole pancreatiche dei ratti non diabetici. Inoltre, nel gruppo STZ-diabetico, la diminuzione del numero di cellule beta immunopositive all’insulina è stata corretta per raggiungere il livello di controllo soprattutto con la dose più alta di vanadio. Pertanto, il trattamento VOSO4 ha normalizzato i livelli plasmatici di glucosio e insulina e ha migliorato la sensibilità all’insulina nel diabete da STZ e ha indotto la proliferazione e/o la rigenerazione delle cellule beta nei ratti normali o diabetici.
1. Introduzione
Il vanadio è un metallo di transizione. Si stima che più di 60 mila tonnellate di questo elemento sono emesse nell’atmosfera ogni anno come risultato delle attività umane, soprattutto dalla combustione di combustibili fossili.
Dopo essere entrati nel sistema circolatorio attraverso il tratto gastrointestinale o respiratorio, i composti di vanadio sono trasportati dalla transferrina o, meno comunemente, dall’albumina o dai componenti a bassa molecola del plasma, come i citrati e, in misura minore, i lattati o i fosfati. Molti studi sono stati condotti su derivati inorganici e organici del vanadio in modelli animali di diabete indotto, in cui i composti studiati sono stati trovati per influenzare i livelli di glucosio, colesterolo e trigliceridi, senza significativi effetti collaterali nocivi su somministrazione prolungata. Molti esperimenti sono stati eseguiti anche in pazienti diabetici, confermando l’effetto terapeutico dei composti di vanadio sui livelli di glucosio nel sangue con pochi effetti tossici.
Il vanadio (compresi vanadyl e vanadate) ha dimostrato di ridurre il livello di glucosio nel sangue stimolando la glicogenesi, l’assorbimento e il metabolismo del glucosio e inibendo la formazione di glucosio attraverso la gluconeogenesi epatica e la glicogenolisi. È stato trovato che il vanadio e i composti di vanadio esibiscono un’attività simile all’insulina imitando le azioni dell’insulina attraverso l’attivazione della tirosina chinasi del recettore dell’insulina e le vie della cascata di fosforilazione della chinasi. Pertanto, il solfato di vanadile è stato suggerito come agente terapeutico per il trattamento del diabete di tipo 1. Il trattamento con streptozotocina (STZ) distrugge le cellule beta produttrici di insulina del pancreas e i ratti diabetici indotti da STZ sono considerati un modello di diabete mellito di tipo 1. Anche se i composti di vanadio hanno dimostrato di avere proprietà antidiabetiche nel modello diabetico indotto da STZ, il meccanismo delle loro azioni è rimasto attualmente sotto indagine. Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare le risposte di 30 giorni di trattamento con solfato di vanadio in ratti diabetici non diabetici e indotti da STZ.
2. Materiali e metodi
2.1. Preparazione dei ratti diabetici
Gli animali sono stati resi diabetici con un’iniezione intraperitoneale (ip) di STZ in una singola dose di 65 mg/Kg in 0.01 M citrate buffer (pH 4.5). Questo metodo ip è stato scelto sulla base di recenti rapporti che hanno dimostrato un effetto pronunciato di aumento del glucosio in STZ-ratti diabetici.
2.2. Animali e trattamento
Ratti Wistar maschi, di 5-6 settimane (peso 175-200 g), sono stati acquistati dall’Istituto Pasteur di Tunisia e utilizzati in accordo con il Comitato Etico Locale dell’Università di Tunisi per l’uso e la cura degli animali secondo le raccomandazioni NIH. Sono stati forniti di cibo (dieta pellet standard-Badr Utique-TN) e acqua ad libitum e alloggiati cinque per gabbia a temperatura raccolta (22°C) con un ciclo luce-buio di 12 ore. I ratti sono stati divisi in sei gruppi.
Gruppo 1 era animali di controllo non diabetici (controllo ND) e ricevuto ogni giorno un’iniezione intraperitoneale (ip) di NaCl 9. Gruppi 2 e 3 erano ND e ha ricevuto ogni giorno una dose di 5 o 10 mg di VOSO4/Kg, rispettivamente (ND + 5 mg/Kg e ND + 10 mg/Kg), per 30 giorni. Il gruppo 4 era un controllo diabetico (controllo D) iniettato con una singola dose di 65 mg/Kg di STZ. I gruppi 5 e 6 comprendevano animali diabetici STZ trattati con 5 o 10 mg/Kg di VOSO4 durante 30 giorni, rispettivamente (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). I gruppi STZ sono stati trattati con VOSO4 dopo 48 ore di diabete indotto da STZ.
2.3. Saggi biochimici
Tutti gli animali sono stati a digiuno 12 ore prima della determinazione della glicemia con un glucometro (ACCU-CHEK-Active Roche). La sensibilità all’insulina è stata misurata dopo l’iniezione ip di 1 U/Kg di insulina e i livelli di glucosio nel sangue sono stati determinati a intervalli di 30 minuti durante 2 ore come percentuale del livello dell’ormone a .
Gli animali sono stati sacrificati dopo 24 ore dall’ultimo trattamento e il sangue è stato raccolto e il siero è stato elaborato per la stima dell’insulina che è stata determinata dal kit Elisa (distribuito da BioVendor).
2.4. Valutazione immunoistochimica
La colorazione immunoistochimica dell’insulina è stata eseguita per caratterizzare l’integrità delle cellule beta nelle isole di Langerhans. Per questo, le sezioni di tessuto che mostrano la massima superficie più grande delle isole di Langerhans sono state selezionate per il confronto tra i gruppi. Le sezioni sono state prima deparaffinate, idratate attraverso una serie graduale decrescente di etanolo, immerse in tampone citrato (pH 6) per 40 min, e poi incubate con un anticorpo policlonale Guinea Pig anti-insulina diluito in 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Dopo il lavaggio, le sezioni sono state incubate con un anticorpo anti-Guinea Pig coniugato con fosfatasi e la procedura di rivelazione è stata assistita dalla macchina TechMate 500. Infine, le sezioni sono state colorate con ematossilina/eosina.
Dieci isolotti pancreatici per ratto sono stati esaminati al microscopio e il numero di cellule insulino-positive e insulino-negative è stato contato contando i loro nuclei. I dati sono espressi come percentuale di cellule immunopositive all’insulina/numero totale di cellule in ogni isoletta.
2.5. Analisi statistica
La significatività della differenza tra i vari gruppi è stata valutata mediante analisi della varianza a senso unico (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey, e il valore è stato preso come significativo a livello.
3. Risultati
L’effetto del trattamento VOSO4 sui livelli di glucosio nel sangue nei ratti non diabetici (ND) e diabetici (D) è mostrato nella Figura 1. Non ci sono stati cambiamenti significativi nei livelli di glucosio nel sangue nel gruppo ND di controllo durante il trattamento (Figura 1 (a)). Il trattamento dei ratti ND con VOSO4 a 5 o 10 mg/Kg non ha cambiato significativamente i livelli di glucosio nel sangue durante i primi 10 giorni. Tuttavia, il livello di glucosio nel sangue è diminuito significativamente alla fine del trattamento con la dose di 5 mg/Kg ed è stato significativamente ridotto da 15 a 30 giorni con la dose di 10 mg/Kg rispetto al gruppo ND di controllo. Al giorno 30, la diminuzione della glicemia era circa 8 e 15%, rispettivamente, per le dosi di 5 e 10 mg/Kg rispetto al gruppo di controllo. Come sospettato, un notevole aumento del livello di glucosio nel sangue è stato osservato nei ratti di controllo trattati con STZ rispetto agli animali non trattati (contro mg/dL) indicando l’installazione del diabete che è stato mantenuto durante tutto l’esperimento. Il trattamento del gruppo diabetico (D) con 5 mg/Kg di VOSO4 ha ridotto significativamente il livello di glucosio nel sangue dal giorno 10 mentre una dose di 10 mg/Kg ha diminuito il livello di glucosio nel sangue significativamente e gradualmente dal giorno 5 per raggiungere il livello normale al giorno 30. I valori notati di glicemia a 30 giorni erano e contro mg/dL, rispettivamente, in D + 5, D + 10, e controllo D gruppi (Figura 1 (b)).
Tabella 1 ha mostrato i livelli di insulina in ND e D gruppi senza e dopo trattamento VOSO4. I ratti ND trattati con 5 mg/Kg di VOSO4 non hanno mostrato cambiamenti significativi nel livello di insulinemia, ma un marcato aumento è stato ottenuto con 10 mg/Kg rispetto al gruppo ND di controllo ( versus µg/L). Inoltre, nel gruppo D di controllo, l’insulinemia era profondamente diminuita rispetto agli animali ND di controllo (contro µg/L). La somministrazione di VOSO4 nei gruppi D ha aumentato notevolmente l’insulinemia in modo dose-dipendente. Infatti, i livelli di insulina sono stati aumentati nei ratti diabetici da a e µg/L con, rispettivamente, dosi di 5 mg e 10 mg/Kg.
Le variazioni della sensibilità all’insulina dopo l’iniezione ip di insulina (1 U/Kg) negli animali normali e diabetici trattati sono mostrate nella Figura 2. Nei ratti ND, il trattamento con 10 o 5 mg di VOSO4 non ha alterato il profilo della glicemia in risposta alla somministrazione di insulina (Figura 2(a)). Infatti, in questi gruppi, il massimo effetto ipoglicemico dell’insulina è stato osservato da 60 e 90 min, rispettivamente, ed era circa del valore iniziale della glicemia. Gli animali diabetici trattati con la bassa dose di VOSO4 hanno mostrato un profilo di glicemia simile al gruppo D di controllo con una diminuzione massima entro 60 min, mentre quelli trattati con la dose elevata hanno esibito una significativa () e rapida diminuzione massima della glicemia entro 30 min dopo l’iniezione di insulina (Figura 2 (b)).
Nei gruppi di trattamento VOSO4, la dimensione delle isole pancreatiche è stata osservata per essere più grande rispetto ai loro rispettivi gruppi di controllo ND e D (Figure 3 e 4). Le analisi statistiche hanno mostrato che i trattamenti VOSO4 hanno indotto un marcato aumento del numero di cellule immunopositive all’insulina di circa il 20% nei gruppi ND + 5 e 27% in ND + 10 mg/Kg (Figura 5). VOSO4 trattamento aumentato significativamente il numero di cellule immunopositive insulina nei gruppi STZ-diabetici in modo dose-dipendente da 12 e 23%, rispettivamente, con 5 e 10 mg/Kg dosi (Figura 5). Il confronto tra i gruppi trattati con STZ-diabetici e i ratti di controllo ND non ha indicato differenze significative.
(a)
(b)
(c)
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(b)
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Macchiatura immunoistochimica dell’insulina nelle cellule beta dell’isolotto di Langerhans del pancreas da STZ-ratti diabetici. Si noti che ci sono più cellule immunopositive di insulina nei ratti STZ-diabetici trattati che nei ratti STZ-diabetici non trattati. Controllo D (a), D trattato con 5 mg/Kg di VOSO4 (b), e D trattato con 10 mg/Kg di VOSO4 (c). Dieci isolotti per ratto sono stati analizzati. Barra della scala: 50 µm.
Effetto del solfato di vanadile sul numero di cellule beta in %. I valori rappresentano media ± SD. ; contro controllo ND. ; contro controllo D. contro D + 5 mg/Kg. 10 isolotti per ratto sono stati analizzati.
4. Discussione
Abbiamo studiato le proprietà antidiabetiche di vanadio esplorando i suoi effetti sulla glicemia e livelli di insulina così come le cellule B del pancreas endocrino.
Utilizzando ratti diabetici indotti da STZ, abbiamo dimostrato che il trattamento con solfato di vanadile (VOSO4) a 5 e 10 mg/Kg ha ridotto significativamente i livelli medi di glucosio nel sangue al 10° e 5° giorno, rispettivamente, in confronto al gruppo di controllo non trattato. Al 30° giorno, i ratti diabetici a cui è stata somministrata la dose più alta del composto hanno mostrato un livello di glicemia simile a quello degli animali di controllo ND. Tuttavia, nei ratti ND, il trattamento con la dose più bassa di VOSO4 non ha cambiato significativamente il livello di glucosio nel sangue, mentre la dose più alta ha indotto una piccola e graduale diminuzione entro il giorno 15 del trattamento e la glicemia è diminuita di circa il 14% al giorno 30. I nostri risultati sono in accordo con i dati precedenti che dimostrano che la somministrazione orale di composti di vanadio negli animali diabetici indotti da STZ o geneticamente ereditati o nutrizionali ha migliorato significativamente l’iperglicemia. Negli esseri umani, Soveid et al. hanno riferito la sicurezza e l’efficacia della terapia orale con solfato di vanadile per un periodo di 30 mesi in pazienti diabetici di tipo 1, diminuendo il bisogno di insulina e il livello di glucosio nel sangue.
Il nostro studio ha anche rivelato che l’effetto ipoglicemico di VOSO4 era accompagnato da un marcato aumento del livello di insulinemia basale nel gruppo diabetico in modo dose-dipendente. Con la dose di 10 mg, il livello di insulinemia dei ratti diabetici era quasi normalizzato. Infatti, la diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue registrati in particolare nei ratti diabetici esposti al composto di vanadio può essere legata al concomitante aumento delle concentrazioni di insulina nel plasma. Questi risultati erano in accordo con i dati precedenti riguardanti l’efficacia dei composti di vanadio nel migliorare lo stato diabetico.
Inoltre, abbiamo studiato l’effetto della somministrazione di vanadio sulla sensibilità all’insulina nei ratti diabetici e non diabetici. Nei gruppi ND, abbiamo mostrato un massimo effetto ipoglicemico dell’insulina a 60-90 min dopo l’introduzione dell’ormone. Tuttavia, nei gruppi D, il trattamento VOSO4 con una dose di 10 mg ha migliorato la sensibilità insulinica con una diminuzione più rapida e pronunciata della glicemia dopo l’iniezione dell’ormone, mentre la dose di 5 mg non ha cambiato significativamente la risposta alla glicemia dei ratti D. Il miglioramento della sensibilità all’insulina indotta da VOSO4 è in linea con numerosi studi che indicano che il vanadio può essere considerato come un potente mimetico dell’insulina o trofico dell’insulina in vari tessuti.
E’ stato dimostrato che i composti del vanadio sono caratterizzati da molteplici modi di azione con conseguente diminuzione della glicemia. Studi in vivo e in vitro hanno riportato che il solfato di vanadile ha aumentato il trasporto e il metabolismo del glucosio nei muscoli scheletrici, nel fegato e nei tessuti adiposi. Grazie alla loro somiglianza strutturale con gli anioni ortofosfati, i derivati organici del vanadio inibiscono la fosfatasi della proteina fosfotirosina. Inibiscono anche l’attività di PTP-1B, enzima responsabile della defosforilazione del recettore dell’insulina, causando la resistenza all’insulina. Un altro meccanismo di riduzione dei livelli di glucosio nel sangue da parte dei composti di vanadio è l’attivazione della chinasi PKB/Akt che porta all’aumento dell’assorbimento del glucosio da parte del trasportatore GLUT4. L’attivazione di PKB/Akt stimola anche la fosforilazione di GSK3, con conseguente stimolazione della sintesi del glicogeno. D’altra parte, è stato trovato che l’inibizione di C-jun N-terminal kinase migliora la sensibilità all’insulina nel diabete sperimentale.
Il vanadio aumenta il trasporto e l’ossidazione del glucosio e l’attività della tirosin-chinasi del recettore dell’insulina ed esercita effetti simili all’insulina sul metabolismo del glucosio e dei lipidi attraverso vie biochimiche insulino-dipendenti o insulino-indipendenti.
È noto che il trattamento STZ distrugge le cellule beta delle isole pancreatiche inducendo il diabete mellito insulino-dipendente. Così, nel presente studio, abbiamo mostrato una riduzione dell’area delle isole pancreatiche associata ad una marcata diminuzione del numero di cellule beta immunoreattive per l’insulina nel gruppo diabetico rispetto agli animali di controllo non diabetici. Tuttavia, in entrambi i gruppi ND e D, il trattamento VOSO4 ha ingrandito le dimensioni delle isole pancreatiche rispetto ai rispettivi gruppi di controllo. Soprattutto, il trattamento VOSO4 di ratti diabetici aumentato in modo dose-dipendente il numero di cellule beta immunopositive insulina come distinto dal gruppo diabetico non trattato, suggerendo che VOSO4 può generare le cellule beta in STZ-indotti ratti diabetici. Infatti, il numero di cellule beta nelle isole dei ratti diabetici trattati con VOSO4 con 5 e 10 mg non era significativamente diverso da quello del gruppo ND. Questo è in accordo con le indagini precedenti riguardanti la proprietà insulinotropica pancreatica di questo composto. È interessante notare che il trattamento con vanadio ha anche aumentato significativamente il numero di cellule beta nelle isole di ratti non diabetici.
In un modello murino di segmento pancreas alloxan-perfuso, Waguri et al. hanno riportato processi di rigenerazione delle cellule beta da cellule precursori extra-islet. Infatti, nei ratti STZ-diabetici, il trattamento VOSO4 potrebbe stimolare la proliferazione delle cellule beta dalle cellule endocrine intraislet e la differenziazione dalle cellule precursori extra-isletarie.
In conclusione, il presente studio dimostra che il solfato di vanadile potrebbe essere utile come un potenziale agente antidiabetico. Tuttavia, poiché le prove attuali sono ancora limitate e basate principalmente su modelli animali e poco si sa sulle formulazioni terapeutiche e gli effetti collaterali dei composti di vanadio, sono necessarie ulteriori indagini sul loro uso a lungo termine come terapia convenzionale per i pazienti diabetici.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimento
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero tunisino dell’istruzione superiore e della ricerca scientifica.