La seguente spiegazione dettagliata dei test sierologici per la celiachia è stata scritta da Tom Ryan, Technical Service Specialist, INOVA Diagnostics, Inc.

Di recente ci sono state molte discussioni sui test sierologici per la celiachia, in particolare sui test tTG (transglutaminasi tissutale). Cercherò di rispondere ad alcune delle molte domande che sono apparse su questa lista su tutti i test. In primo luogo, e questo vale per tutti gli esami del sangue, è necessario essere attualmente su una dieta contenente glutine perché i test siano accurati. Gli anticorpi sono prodotti dal sistema immunitario in risposta a sostanze che il corpo percepisce come minacciose. La risposta immunitaria che il tuo corpo produce è la sua risposta all’esposizione al glutine nella dieta e al suo conseguente effetto sulla mucosa intestinale. Se non c’è glutine nella dieta, allora non c’è nessuna risposta che possiamo misurare. Un breve cambiamento nella dieta non avrà un effetto evidente. Se siete stati senza glutine per una settimana o giù di lì, non farà una grande differenza. La risposta potrebbe essere marginalmente inferiore, ma la differenza è insignificante perché il corpo non ha avuto il tempo di rispondere al cambiamento. Al contrario, se sei stato senza glutine per un lungo periodo di tempo e decidi di essere testato, una breve sfida di un paio di settimane non è sufficiente per suscitare una risposta e ottenere un test accurato.

Ci sono diversi passaggi che avvengono per generare una risposta immunitaria e ci vuole tempo sia per la reazione positiva quando il glutine è presente sia per cancellare gli anticorpi quando il glutine viene eliminato. C’è stata una grande discussione su quanto e come dovrebbe essere lunga una sfida e non c’è consenso. Parlate con il vostro medico. La mia sensazione personale è che il minimo sia 2 fette di pane al giorno per 6 settimane per ottenere un test accurato, ma non cercherei di giudicare il medico. Ci sono fondamentalmente quattro test che possono essere eseguiti per aiutare a diagnosticare la celiachia. Notate che ho detto che aiutano a diagnosticare la celiachia. L’immunologia è abbastanza accurata, ma è lontana dall’essere una scienza esatta. Tutti i test di laboratorio, indipendentemente dal tipo o dalla fonte, sono presentati come aiuti alla diagnosi. Non dovrebbero essere usati da soli come base per la diagnosi, ma piuttosto devono essere considerati insieme all’esame fisico del paziente e ai sintomi riportati, ecc. da un medico esperto. C’è stata molta confusione su cosa sono i test e spero di alleviare alcuni dei malintesi. Ci sono molti termini che sentiamo: tTG, IgA, IgG, ELISA, ecc. Cosa sono tutti questi? Alcuni collaboratori alla lista fanno riferimento al test IgA o IgG o al test ELISA. Queste etichette sono incomplete per i nostri scopi e potrebbero riferirsi a qualsiasi numero di test diversi.

Tutti noi abbiamo, all’interno del nostro corpo, una famiglia di proteine strettamente correlate, anche se non identiche, che sono in grado di agire come anticorpi. Queste vengono chiamate collettivamente immunoglobuline. Cinque tipi principali di immunoglobuline sono normalmente presenti nell’adulto umano. Sono IgG, IgA, IgM, IgE e IgD. Ognuno di questi è un modo abbreviato di scrivere immunoglobulina gamma G (o A o M, ecc.) e ognuno di essi svolge una funzione diversa nel nostro sistema. Le IgG sono le principali immunoglobuline nel siero umano. È importante nel fornire l’immunità in un feto in via di sviluppo perché passerà attraverso la barriera placentare. Le IgA sono le principali immunoglobuline nelle secrezioni della mucosa respiratoria e intestinale. Le IgE sono una gamma globulina prodotta dalle cellule che rivestono il tratto intestinale e respiratorio. Produce gli anticorpi associati alla maggior parte delle risposte di ipersensibilità (allergiche). È associata all’asma, alla febbre da fieno, ecc. IgM è una globulina che si forma in quasi tutte le risposte immunitarie nella parte iniziale della reazione. IgD è una proteina rara presente in quantità minime nei sieri normali. Queste denominazioni si riferiscono al tipo di proteina che trasporta l’anticorpo in questione. Vengono prodotti entrambi i sottotipi IgG e IgA di anticorpi anti-gliadina, quindi ci si riferisce a loro come gliadina IgG o gliadina IgA. Collettivamente sono anticorpi anti-gliadina.

Anticorpi anti-gliadina:

Si rilevano sia anticorpi IgA che IgG anti-gliadina (AGA) nei sieri dei pazienti con enteropatia sensibile al glutine (malattia celiaca). Gli anticorpi antigliadina IgG sono più sensibili ma sono marcatori meno specifici della malattia rispetto agli anticorpi di classe IgA. Gli anticorpi IgA anti-gliadina sono meno sensibili ma più specifici. Negli studi clinici, gli anticorpi IgA hanno una specificità del 97% ma la sensibilità è solo del 71%. Ciò significa che, se un paziente è IgA positivo, c’è una probabilità del 97% che abbia la celiachia. Al contrario, se il paziente è IgA negativo, c’è solo un 71% di probabilità che il paziente sia veramente negativo per la celiachia. Pertanto, un risultato positivo è una forte indicazione che il paziente ha la malattia, ma un risultato negativo non significa necessariamente che non ce l’ha. I falsi risultati positivi sono piuttosto rari, ma i falsi risultati negativi possono verificarsi. D’altra parte, gli anticorpi IgG anti-gliadina sono specifici al 91% e hanno una sensibilità dell’87%. Questo significa che mostreranno risultati positivi più facilmente, ma non c’è una correlazione così forte con la malattia celiaca. È meno specifico. I pazienti con altre condizioni, ma non affetti da malattia celiaca, occasionalmente mostreranno risultati positivi. Gli anticorpi IgG anti-gliadina sono rilevabili in circa il 21% dei pazienti con altri disturbi gastrointestinali. Questo test potrebbe dare risultati falsi positivi, ma è meno probabile che dia risultati falsi negativi.

Un protocollo di test sensibile include il test per gli anticorpi anti-gliadina sia IgA che IgG, poiché una parte significativa dei pazienti celiaci (circa il 2-5%) è carente di IgA. Questo test combinato degli anticorpi IgA e IgG anti-gliadina ha una sensibilità complessiva del 95% con una specificità del 90%. Il tipo di test utilizzato per rilevare gli anticorpi anti-gliadina si chiama ELISA. Questo è un acronimo e sta per Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay. L’ELISA non è un test in sé. È un metodo di test ed è un test relativamente semplice da eseguire. Si tratta di mettere una quantità misurata di siero diluito del paziente nei pozzetti di una piastra appositamente costruita e preparata e di incubarla per un periodo di tempo con varie sostanze chimiche. Il risultato finale è un cambiamento di colore, la cui intensità dipende dalla concentrazione di anticorpi anti-gliadina (o di altre proteine da misurare) nel siero del paziente. La capacità di questa soluzione colorata di assorbire la luce a una particolare lunghezza d’onda può essere misurata su uno strumento di laboratorio e confrontata matematicamente con soluzioni che contengono una quantità nota di anticorpo anti-gliadina per arrivare a un numero per la quantità di anticorpo presente. Il campione può quindi essere classificato come negativo, (0-20 unità); debolmente positivo, (21-30 unità); o moderatamente o fortemente positivo se superiore a 30 unità. Lo scopo del test per gli anticorpi anti-gliadina include, oltre alla diagnosi di enteropatia sensibile al glutine, il monitoraggio della conformità a una dieta senza glutine. Gli anticorpi IgA alla gliadina aumentano rapidamente in risposta al glutine nella dieta e diminuiscono rapidamente quando il glutine è assente dalla dieta. Gli anticorpi IgA anti-gliadina possono scomparire completamente in 2-6 mesi con una dieta senza glutine, quindi sono utili come controllo della dieta. Al contrario, gli anticorpi IgG anti-gliadina hanno bisogno di molto tempo, a volte più di un anno, per diventare negativi. È vero anche il contrario. Cioè, un paziente con malattia celiaca che ha seguito una dieta senza glutine ed è risultato negativo agli anticorpi IgA anti-gliadina, mostrerà un rapido aumento della produzione di anticorpi quando viene sfidato dal glutine nella dieta. Circa il 90% dei pazienti sottoposti a sfida darà un risultato positivo agli anticorpi IgA anti-gliadina entro 14-35 giorni dalla sfida. Gli anticorpi IgG sono un po’ più lenti.

Anticorpi endomisiali:

Gli anticorpi anti-endomisio di classe IgA (AEA) sono molto specifici e si presentano solo nella malattia celiaca e nella DH. Questi anticorpi si trovano in circa l’80% dei pazienti con DH e sostanzialmente nel 100% dei pazienti con malattia celiaca attiva. Gli anticorpi endomisiali IgA sono più sensibili e specifici degli anticorpi alla gliadina per la diagnosi della celiachia. I titoli anticorpali (diluizioni) sono risultati paralleli ai cambiamenti morfologici nel digiuno e possono anche essere utilizzati per riflettere la conformità alle diete senza glutine. I titoli diminuiscono o diventano negativi nei pazienti che seguono una dieta priva di glutine e ricompaiono con la sfida del glutine.

Il test per gli anticorpi anti-endomisio è più soggettivo e più complicato da eseguire per il laboratorio rispetto ai test anti-gliadina. Comporta la diluizione in serie di una parte del siero del paziente, cioè la diluizione di ½, poi ¼, 1/8, 1/16, ecc. e la messa di queste diluizioni su un vetrino che ha una specie di tessuto apposto su di esso. Il vetrino viene poi trattato con varie soluzioni ed esaminato al microscopio a fluorescenza per determinare se il siero si lega a qualche proteina del tessuto. Se è così, allora è confermato che il paziente ha anticorpi contro quella particolare proteina. Questo metodo di analisi è chiamato IFA o a volte IIFA. Sta per Indirect Immuno-Fluorescent Assay. La selezione del vetrino di tessuto da utilizzare è determinata da quale proteina specifica, quindi quale anticorpo, si sta cercando in modo specifico. Gli anticorpi endomisiali reagiscono con l’endomisio, che è una guaina di fibrille reticolari che circondano ogni fibra muscolare. Pertanto, per rilevare gli anticorpi endomisiali, si desidera utilizzare un substrato di tessuto che contiene molto tessuto muscolare. Il substrato usato più spesso per questo test è costituito da sezioni distali dell’esofago. Queste sono tagliate molto sottili e fissate al vetrino. Contengono fibre muscolari e non molto altro, quindi c’è molto endomisio disponibile per reagire con gli anticorpi anti-endomisio.

La lettura di questo test comporta la visualizzazione dei vetrini reagiti con un microscopio fluorescente per effettuare la determinazione. Questo richiede un occhio altamente qualificato e addestrato e, necessariamente, è un po’ soggettivo. Si cerca una fluorescenza verde nell’endomisio che copre le fibre muscolari. Il test viene riportato come titolo o diluizione finale in cui la fluorescenza può ancora essere vista chiaramente. Come si può immaginare, questo è molto soggettivo. Non ci sono valori standardizzati e sta al giudizio del tecnico particolare stabilire quale sia il titolo finale. Recentemente, (1998) l’antigene endomisiale mirato dagli anticorpi anti-endomisio è stato identificato come l’enzima di cross-linking proteico noto come transglutaminasi tissutale (tTG). Questo ha permesso la produzione di un test ELISA specifico per l’antigene che incorpora la tTG come alternativa affidabile e oggettiva ai tradizionali e soggettivi test basati sull’immunofluorescenza. Negli studi clinici, la correlazione con il test IFA endomisiale ha dimostrato di essere vicina al 100%. Si tratta di un test che è stato accolto molto bene nella comunità professionale. Si tratta di un ELISA, come il test degli anticorpi anti-gliadina e, come tale, non è soggetto a interpretazione come l’IFA. Questo è il più grande vantaggio di questo nuovo test! Con questo o qualsiasi altro ELISA, la risposta viene misurata su uno strumento che calcola la quantità di luce di una particolare lunghezza d’onda che viene assorbita dalla soluzione e stampa un risultato numerico. Non c’è possibilità di errore umano che distorca i risultati perché non c’è nessuna chiamata di giudizio coinvolta. La piastra ELISA, indipendentemente da ciò che si sta testando, viene elaborata con almeno tre sieri di controllo (a volte fino a otto) oltre al campione sconosciuto da testare. C’è un siero negativo e almeno due sieri positivi che contengono diversi livelli dell’anticorpo da testare. Ci sono requisiti specifici per i livelli di assorbimento di questi tre controlli. Cioè, ognuno di essi ha un numero minimo o massimo (o entrambi) che deve essere visto dallo strumento perché sia un test valido. Se c’è uno scostamento da questi numeri attesi, è un’indicazione che qualcosa è andato storto e i risultati del test vengono scartati e il test ripetuto. Non c’è quindi modo che il tecnico possa riportare risultati imprecisi (supponendo che abbia diluito correttamente il campione). O il test era valido, e si può fare affidamento sull’accuratezza del risultato, o il test non è valido, e l’intero risultato viene scartato. Se è stato commesso un errore durante l’elaborazione della piastra ELISA, i numeri dei sieri di controllo risulterebbero fuori dal range e l’intero risultato del test verrebbe scartato.

In sintesi, l’ELISA tTG misura la stessa cosa che misura l’IFA endomisiale ma con un metodo che è più sensibile e specifico e non soggetto a interpretazione. Gli anticorpi di Reticulina di classe IgA si trovano solo nella Celiachia e nella dermatite erpetiforme. Questi anticorpi si trovano in circa il 60% dei pazienti celiaci e nel 25% dei pazienti con DH. Questo test sta cadendo in disuso a causa della limitata utilità e della disponibilità di test migliori. Si tratta di un IFA eseguito su un substrato di tessuto con tutti i problemi che ne conseguono. Lo sviluppo di tutti questi test sul siero ha semplificato enormemente la diagnosi della malattia celiaca e ne ha migliorato anche la precisione. I criteri originali per la diagnosi secondo la Società Europea di Gastroenterologia e Nutrizione Pediatrica (ESPGAN), prevedevano un anno di studi ardui con:

• una biopsia intestinale iniziale positiva;
• 6 mesi di dieta senza glutine;
• una seconda biopsia intestinale negativa;
• una sfida al glutine per 6 mesi e;
• una terza biopsia intestinale positiva. I criteri ESPGAN rivisti richiedono risultati positivi in due dei test sierologici confermati da una singola biopsia positiva. In pratica, molti gastroenterologi stanno utilizzando le sierologie in combinazione con una dieta controllata e la presentazione clinica per formare una base per la diagnosi senza la necessità della procedura invasiva.

Grazie agli auspici della Celiac Disease Foundation e altri, un simposio professionale e un workshop sono stati organizzati all’inizio di quest’anno a Marina Del Rey, California, con partecipanti dall’Europa e dagli Stati Uniti per stabilire degli standard per riportare i risultati dei test. Questo dovrebbe migliorare ancora di più i test e la diagnosi. Alla conclusione di questa conferenza è stato formato un comitato di standardizzazione della malattia celiaca per indagare e fare raccomandazioni su un metodo standardizzato di segnalazione dei risultati.