I test sulla concentrazione minima inibitoria (MIC) e sulla concentrazione minima battericida (MBC) definiscono la potenza di un materiale di prova in termini di concentrazione alla quale inibisce la crescita di (concentrazione minima inibitoria, o MIC) o uccidere completamente (Concentrazione battericida minima, o MBC) 1 x 106 (un milione) di microrganismi di sfida durante un periodo di 18-20 ore di esposizione incubata (35 ± 2°C).
Il metodo MIC misura l’effetto di concentrazioni decrescenti di antisettico per un periodo di tempo definito in termini di inibizione della crescita della popolazione microbica. La concentrazione di farmaco necessaria per produrre l’effetto è definita come la Concentrazione Minima Inibitoria, ed è normalmente da diverse centinaia a migliaia di volte inferiore alla concentrazione trovata nella forma di dosaggio finita.
Methods For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Il riferimento standard usato come base per eseguire la determinazione della concentrazione minima inibitoria (MIC) è la versione più recente di Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (attualmente, CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute) o anaerobicamente (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & Panoramica del test MBC
Il prodotto viene diluito in serie 1:2 in un terreno di coltura adatto a sostenere la crescita di ciascun microrganismo in esame, solitamente Mueller-Hinton Broth (MHB) o Mueller-Hinton Agar (MHA), per produrre una serie di diluizioni del prodotto nel terreno fino a 1:32.768 (secondo BSLI SOP L-2045). Tuttavia, a seconda del tipo di prodotto, la serie di diluizione può non essere effettuata fino a questo punto. Alle provette della serie, ciascuna contenente un’aliquota di 2,0 mL del prodotto diluito in serie nel terreno di crescita, viene ora aggiunto 1,0 mL di una sospensione 1 x 106 CFU/mL di una specie di sfida. Dopo le 18-24 ore di esposizione incubata, le provette contenenti la sospensione di microrganismo/prodotto/mezzo di sfida vengono esaminate per determinare la più alta diluizione di prodotto (e viceversa, la più bassa concentrazione di prodotto) che inibisce completamente la crescita del microrganismo, come determinato ad occhio nudo. Questo valore di diluizione (e/o di concentrazione del prodotto) viene registrato come valore della concentrazione minima inibitoria.
Se si desidera una determinazione della MBC, le quantità misurate vengono trasferite dalla sospensione di diluizione che rappresenta la concentrazione minima inibitoria, e dalle due o tre sospensioni di diluizione che precedono la diluizione della concentrazione minima inibitoria, a piastre di terreno di crescita solido, che vengono poi incubate per 24 ore a 37E± 2E. Dopo l’incubazione, le piastre vengono esaminate per la crescita del microrganismo di sfida. La diluizione del prodotto (e/o la concentrazione del prodotto) che non produce crescita è registrata come MBC. Si noti che le procedure di test MIC/MBC possono essere eseguite utilizzando diluizioni seriali 1:2 del prodotto in agar nutriente (test in fase solida) o utilizzando diluizioni seriali 1:2 del prodotto in brodo nutriente (test in sospensione). A meno che lo sponsor non richieda specificamente il metodo di diluizione in agar, BSLI eseguirà il test MIC utilizzando il metodo di diluizione in brodo macrotube, perché è molto meno dispendioso in termini di materiali e di tempo.
Prodotti testati nell’ambito di un Investigational New Drug
Per i prodotti che devono essere testati sotto un IND, la FDA specifica chiaramente a pagina 31444 del TFM quali microrganismi devono essere utilizzati per testare i prodotti in vitro. Per lo studio della concentrazione minima inibitoria, il TFM afferma che il prodotto finito, il principio attivo del prodotto e il veicolo del prodotto devono essere sfidati ciascuno con 25 ceppi ATCC e 25 ceppi freschi isolati clinicamente di ciascuna delle 12 specie batteriche Gram-negative e 11 Gram-positive e dei due gruppi di specie di lieviti (Candida albicans e Candida spp., non albicans). Questo, quindi, comprende uno studio molto ampio che prevede di testare 1.250 ceppi dei 25 batteri e lieviti totali che sono specificati nel TFM rispetto a ciascuna delle tre configurazioni di prodotto.
Negli ultimi anni, la FDA si è un po’ allontanata da questo requisito oneroso – anche se il prodotto finito deve essere testato contro i 1.250 ceppi, come detto, il principio attivo del prodotto e il veicolo del prodotto devono essere testati solo con cinque ceppi ATCC e cinque ceppi freschi isolati clinicamente di ciascuna delle 25 specie di batteri/lieviti. Anche così, il totale è di 250 ceppi che devono essere testati sia per l’attivo che per il veicolo, e lo studio complessivo TFM MIC è piuttosto massiccio e costoso – in totale, 1.750 determinazioni di concentrazione minima inibitoria individuali. La FDA permette anche alcune sostituzioni di specie (per esempio, specie di Bacteroides diverse da B. fragilis, e specie di Stafilococco coagulasi-negativo diverse da S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus, e S. saprophyticus) per adattarsi alla scarsità di ceppi ATCC e/o isolati clinici di alcune delle specie richieste dal TFM. E, riconoscendo che, in generale, gli alcoli non sono antimicrobicamente attivi dopo circa due diluizioni 1:2, la FDA non richiede dati MIC per i prodotti in cui un alcool è l’unico componente attivo.
MIC & MBC Prova di concetto in scopi di marketing
Anche se BSLI ha eseguito molti degli studi di concentrazione minima inibitoria completi richiesti dal TFM per i prodotti registrati IND, la maggior parte degli studi di concentrazione minima inibitoria e MBC occasionali sono eseguiti per la prova di concetto e scopi di marketing. In questo tipo di studi, BSLI raccomanda generalmente ai clienti di testare i ceppi ATCC di tutte e 25 le specie/ceppi elencati nel TFM, più un isolato clinico di ciascuno (cioè, un totale di 50 ceppi di sfida).