La morte cellulare è cruciale per la corretta esecuzione dei processi normali e fisiopatologici ed è onnipresente nei sistemi biologici.

Le forme programmate di morte cellulare sono responsabili della produzione di modelli morfologici durante lo sviluppo, della selezione negativa durante l’immunità e della “corsa agli armamenti” molecolare che si verifica tra i geni virali e quelli dell’ospite durante l’infezione, così come dei danni ai tessuti che si verificano con fattori di stress ambientali come le genotossine.

Le alterazioni all’interno di queste vie di morte cellulare possono manifestarsi come malattia, compreso il cancro, i disturbi degenerativi e la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). La capacità delle cellule tumorali di eludere la morte cellulare programmata è un segno distintivo della maggior parte dei tipi di cancro.

Negli ultimi anni è diventato chiaro che la semplice misurazione di singoli segni distintivi delle cellule morenti, come la frammentazione nucleare o la permeabilità della membrana, non è sufficiente per discriminare tra le diverse vie di morte cellulare, che includono l’apoptosi, la morte cellulare autofagica e la necrosi.

Quello che serve è una valutazione multiparametrica della morte cellulare che riveli gli eventi meccanici che avvengono “dietro le quinte”. Secondo le raccomandazioni del Nomenclature Committee on Cell Death 2009, i processi di morte cellulare (apoptosi, necrosi, autofagia) possono essere classificati secondo l’aspetto morfologico, i criteri enzimologici, gli aspetti funzionali e le caratteristiche immunitarie.

Morte cellulare in varie forme

Apoptosi

L’apoptosi si riferisce a un programma di suicidio cellulare diretto dal gene. Un’ampia varietà di proteine cellulari, compresi i recettori della superficie cellulare, le proteasi e i componenti mitocondriali, regolano un delicato equilibrio tra la sopravvivenza cellulare e la morte per apoptosi. Le mutazioni all’interno di queste proteine possono far saltare l’equilibrio, con conseguente sopravvivenza incontrollata e proliferazione delle cellule tumorali. Pertanto, scoprire i meccanismi dell’apoptosi può portare a nuove strategie per sfruttare questa forma di morte cellulare a fini terapeutici.

L’apoptosi è accompagnata da una riduzione del volume delle cellule, dalla condensazione nucleare, dalla frammentazione del DNA, dallo spurgo della membrana plasmatica e dall’ingestione da parte dei fagociti. Inoltre, l’apoptosi coinvolge tipicamente la permeabilitazione della membrana mitocondriale, seguita dall’attivazione della cascata di caspasi; tuttavia, le proteasi non-caspasi possono essere attivate alternativamente.

Necrosi

La necrosi è stata storicamente considerata una forma passiva di morte cellulare. Tuttavia, dati recenti suggeriscono che la necrosi può anche essere una forma alternativa di morte cellulare programmata la cui attivazione può avere conseguenze importanti, come l’induzione di una risposta infiammatoria. La necrosi e l’apoptosi sono morfologicamente molto distinte. La necrosi è accompagnata da un aumento di volume delle cellule, dal rigonfiamento degli organelli, dalla rottura della membrana plasmatica e dalla perdita del contenuto intracellulare.

Per quanto riguarda la differenza tra apoptosi e necrosi, i vari metodi per distinguere tra morte cellulare apoptotica e necrotica si basano su caratteristiche che possono essere visualizzate e/o misurate, come le dimensioni delle cellule, la frammentazione cellulare e la scissione del DNA.

Autofagia

L’autofagia è un processo degradativo omeostatico altamente regolato in cui le cellule distruggono i propri componenti attraverso il macchinario lisosomiale e li riciclano. Questo processo è associato a diverse malattie tra cui il morbo di Alzheimer, l’invecchiamento, i tumori e il morbo di Crohn. In alcuni casi, l’autofagia elevata contribuisce alla morte cellulare attraverso un’estesa diatriba con le vie di segnalazione pro-apoptotiche. La comprensione della correlazione tra l’autofagia e la morte cellulare apoptotica è al centro di molte ricerche, in particolare nella biologia dei tumori.

Autofagia vs Apoptosi

La morte cellulare autofagica è morfologicamente definita come la morte cellulare che avviene in assenza di condensazione della cromatina ma è accompagnata da una massiccia vacuolizzazione del citoplasma. In contrasto con l’apoptosi, l’autofagia ha poca o nessuna associazione con i fagociti. Durante questa forma di morte cellulare, il materiale citoplasmatico è sequestrato all’interno degli autofagosomi per essere degradato dai lisosomi.

Ora si sa che c’è un cross-talk tra la via apoptotica e quella dell’autofagia, e gli studi hanno dimostrato che BCL2, che è un importante regolatore dell’apoptosi, è anche un importante regolatore della via dell’autofagia.

I recenti progressi nella biologia chimica, nell’analisi dei percorsi e nella citometria sofisticata hanno permesso di approfondire la conoscenza dei marcatori molecolari e dei cambiamenti cellulari che caratterizzano ogni percorso di morte cellulare. Inoltre, l’evoluzione della tecnologia ha anche reso possibile eseguire molte di queste valutazioni come esperimenti di routine da banco, in linea con le analisi a valle. Insieme, questi progressi hanno trasformato lo studio della morte cellulare nella dissezione di reti di segnalazione sfumate che sono integrate in sistemi complessi.

Una delle caratteristiche fondamentali della morte cellulare che la comunità scientifica sta cercando di dissezionare è il punto di non ritorno lungo queste vie sfumate. Ci sono sia punti reversibili che irreversibili lungo ogni via di segnalazione della morte cellulare e determinare dove si trova il punto di transizione in vari contesti è di grande importanza dal punto di vista del tentativo di intervenire nel processo. Indipendentemente dal tipo di morte cellulare, una volta che la cellula ha superato il punto di non ritorno, la morte non può essere impedita.

Analisi della morte cellulare

Per sezionare, caratterizzare e differenziare le varie forme di morte cellulare, sono necessari due tipi di criteri: descrittivi (per esempio, l’imaging) e funzionali (per esempio, l’inibizione dei percorsi). Per esempio, la frammentazione del DNA e l’attivazione della caspasi possono aiutare a definire l’apoptosi, ma queste analisi non sono definitive se usate isolatamente perché l’apoptosi può avvenire senza frammentazione del DNA, e l’attivazione della caspasi è anche legata ad altri processi biologici.

Pertanto, la morte cellulare dovrebbe sempre essere misurata con metodi multipli, preferibilmente nello stesso campione, combinando saggi biochimici e morfologici quando possibile. Una gamma di tecnologie può fornire informazioni preziose sulle varie vie di morte cellulare, tra cui l’imaging, TUNEL, saggi basati sull’immunologia, citometria a flusso, citometria basata sull’imaging e tecnologie per l’imaging di cellule aderenti. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi comuni e intrinseci con i metodi attuali per indagare la morte cellulare che possono limitare la loro utilità.

Per esempio, tecnologie come Western Blotting e ELISA non sono in grado di fornire cambiamenti specifici per cellula, anche se sono molto utili per raccogliere informazioni sul cambiamento totale del processo. Alcuni metodi di imaging possono avere limitazioni sul fatto che un numero equivalente di cellule venga contato tra un campione e l’altro, o che venga contato un numero sufficiente di cellule, il che potrebbe avere un impatto sulla riproducibilità e/o sull’accuratezza dei risultati.

All’altra estremità, metodi come la citometria a flusso multiparametrico o la citometria per immagini possono essere molto potenti e fornire dati ricchi di contenuti per le analisi di morte cellulare, ma questi metodi possono anche avere limitazioni. Per esempio, l’accesso alla strumentazione può essere limitato, ci può essere un requisito per una grande esperienza e formazione, e l’accessibilità economica può essere una sfida.

C’è un bisogno nell’industria di metodologie facili da usare, convenienti e accessibili che possano fornire in modo robusto, accurato e riproducibile risposte a domande comuni e quotidiane che i ricercatori stanno studiando nella salute e nella morte cellulare. I metodi consolidati ed emergenti per discriminare efficacemente tra apoptosi, necrosi e autofagia sono descritti di seguito.

Imaging

La morte cellulare è in definitiva un processo morfologico e il gold standard per analizzare questo processo è la visualizzazione delle cellule. Quando si assiste alla morte cellulare in coltura, diventa molto evidente ciò che sta accadendo. Per esempio, durante l’apoptosi, le cellule si arrotondano e sembrano bollire (‘blebbing’). Ci sono molteplici approcci disponibili per l’imaging della morte cellulare, compresa la semplice visualizzazione delle cellule in tempo reale in coltura, la colorazione delle cellule con l’arancio di acridina (un colorante vitale specifico per le cellule apoptotiche), la colorazione istologica del tessuto fissato e la microscopia elettronica. Ci sono anche nuove opzioni disponibili nella citometria a immagini, come descritto più avanti.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

La procedura Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) è un metodo molto comune per esaminare la frammentazione del DNA che risulta dall’apoptosi. TUNEL etichetta le estremità terminali del DNA che vengono scisse nella regione spaziale tra i nucleosomi nella cromatina, e queste rotture del filamento di DNA vengono visualizzate al microscopio ottico. Sebbene il TUNEL sia un test molto efficace per l’apoptosi, una grande limitazione di questo approccio è che il TUNEL rileva le cellule apoptotiche all’ultimo stadio del processo.

Attivazione delle caspasi

A livello molecolare, una serie di enzimi noti come caspasi sono ampiamente responsabili dell’esecuzione della via della morte cellulare apoptotica, ma non necrotica. In risposta a segnali pro-apoptotici, le caspasi partecipano a una serie di reazioni che portano alla scissione di substrati proteici, causando lo smontaggio della cellula. Le caspasi esistono in ogni cellula del corpo come proenzimi dormienti. Durante l’apoptosi, le caspasi formano molecole tetrameriche enzimatiche attive che possono attivare o inattivare i loro substrati.

Questi enzimi riconoscono specificamente una sequenza di quattro o cinque aminoacidi sul substrato bersaglio, che include un residuo di acido aspartico come obiettivo della scissione. Le caspasi funzionano in altri processi biologici, come l’immunità; infatti, molti genomi virali codificano per inibitori diretti di queste caspasi. Le caspasi possono essere rilevate tramite tecniche di immunoprecipitazione o immunoblotting utilizzando anticorpi specifici per le caspasi, o utilizzando substrati fluorocromatici che diventano fluorescenti dopo la scissione da parte della caspasi. Inoltre, il coinvolgimento delle caspasi può essere visualizzato trattando colture vive con Smac mimetico, un induttore molto potente di apoptosi.

Rilevamento mitocondriale

Gli mitocondri sono regolatori chiave dei processi di morte cellulare come l’apoptosi. La perdita del potenziale transmembrana interno mitocondriale è spesso, ma non sempre, associata alle prime fasi dell’apoptosi e si ritiene che abbia un ruolo nella morte cellulare indipendente dalla caspasi. I saggi basati sulla fluorescenza progettati per valutare lo stato funzionale dei mitocondri sono strumenti utili per esaminare il ruolo dell’attività mitocondriale nella cascata dell’apoptosi.

Fosfatidilserina e annessina V

La fosfatidilserina (PS), confinata al foglietto interno della membrana delle cellule vitali, si trasferisce alla superficie esposta della membrana durante le prime fasi dell’apoptosi. Questo evento serve come segnale per le cellule fagocitiche che attaccano. La PS è esposta principalmente alle macchie superficiali delle cellule apoptotiche. L’annessina V ha un’alta affinità per le membrane contenenti la PS caricata negativamente. Questi eventi possono essere visualizzati usando la citometria a flusso.

Citometria a flusso

I test di citometria a flusso per l’apoptosi hanno ormai quasi 25 anni. I primi test di citometria a flusso per l’apoptosi analizzavano i cambiamenti nella dispersione in avanti e laterale e la frammentazione del DNA dopo il trattamento con etanolo. I test di citometria a flusso ora mirano a quasi tutte le fasi dell’apoptosi, dai primi cambiamenti mitocondriali all’attivazione delle caspasi, ai cambiamenti di membrana e ai danni al DNA. A differenza dei saggi precedenti, la citometria a flusso analizza l’apoptosi nelle singole cellule.

La citometria a flusso multiparametrica è un approccio ideale per combinare più saggi di morte cellulare. Il rilevamento della caspasi FLICA, l’annessina V e un colorante che lega il DNA (per esempio, lo ioduro di propidio) possono essere combinati in un potente test multistadio per l’apoptosi (Figura 1).

La combinazione di questi test permette di analizzare la progressione dell’apoptosi e fornisce un quadro molto più ricco di quello che può fornire un solo test.

Una piattaforma di citometria a flusso da banco può anche fornire informazioni quantitative cellulari istantaneamente per molte analisi di salute cellulare, morte cellulare, segnalazione cellulare, immunologia e ciclo cellulare. Uno di questi strumenti utilizza i principi della citometria microcapillare, che permette l’analisi di campioni di piccole dimensioni. La piattaforma è chiusa, per cui i reagenti e il software sono strettamente accoppiati per applicazioni dedicate, al fine di semplificare il processo e ridurre la complessità analitica per eseguire e ottenere dati basati sulla citometria.

La tecnologia permette l’analisi di due marcatori simultaneamente e può essere utilizzata per eseguire studi sul corso del tempo e sulla dose-risposta, fornendo così approfondimenti sui meccanismi in gioco e un quadro più completo del processo di morte cellulare (Figura 2).

Ad oggi, c’è solo un saggio di citometria a flusso disponibile per analizzare l’autofagia, che comporta la misurazione della catena leggera 3 (LC3). LC3 è una proteina che si segrega negli autofagosomi che fagocitano i mitocondri defunti e altri organelli intracellulari e infine nei lisosomi. L’autofagia può essere rilevata dalla citometria a flusso usando la traslocazione della proteina fluorescente verde (GFP)-LC3 (Figura 3).

In questo test, una linea cellulare è trasfettata in modo stabile con GFP-LC3. Durante l’induzione, viene aggiunto un inibitore del lisozima per bloccare la distruzione degli autofagosomi da parte dei lisosomi. Se si verifica l’autofagia, GFP-LC3 si accumulerà negli autofagosomi quando l’inibitore è presente e non sarà rilasciato nei media. Se l’autofagia non si verifica, allora GFP-LC3 si accumulerà nel citoplasma e sarà rilasciato nei media. GFP-LC3 associato all’autofagosoma può essere rilevato nelle cellule intatte mediante citometria a flusso.

Citometria a immagini

La citometria a immagini permette di raccogliere simultaneamente dati citometrici e immagini cellulari correlate, e ora esistono molte opzioni per questi tipi di analisi. Poiché l’apoptosi è altamente variabile e pleiotropica, l’imaging può fornire la verifica che l’apoptosi si sta verificando e può anche caratterizzare il processo in una certa misura attraverso la visualizzazione della condensazione della cromatina e la rottura del citoscheletro. La citometria per immagini fornisce anche ulteriori opzioni di analisi, compresa l’analisi pixel per pixel, che sono utili per l’analisi apoptotica. Inoltre, il distacco di tripsina o Accutase®, che può “confondere” le etichette apoptotiche, non è necessario.

La citometria a immagini permette anche l’analisi di cellule aderenti senza rimozione delle cellule dal loro substrato. Per questo motivo, molti laboratori utilizzano la citometria a immagini per l’analisi delle cellule apoptotiche aderenti. Le cellule aderenti che vengono strappate dal loro substrato, attraverso la raschiatura o la tripsina, possono interrompere il fenotipo apoptotico, o addirittura indurre il processo apoptotico stesso. La citometria a immagini permette alle cellule aderenti di rimanere aderenti per tutta l’analisi colorando le cellule direttamente sul vetrino della camera. È importante notare che le cellule aderenti si arrotondano una volta che subiscono l’apoptosi, quindi alcune delle cellule che sono nelle fasi successive di apoptosi può essere perso.

Un sistema di citometria di immagine basato sul flusso fornisce anche la correlazione diretta tra citometria e immagini, e quindi combina analisi citometrica e morfologica. In un sistema di imaging basato sul flusso, le cellule non vengono riprese su un vetrino, ma direttamente nel flusso. Quando la citometria e le immagini sono correlate, le cellule vitali, in fase iniziale, intermedia e tardiva di apoptosi possono essere classificate e analizzate (Figura 4).

Conclusione – Morte cellulare: Discriminare tra apoptosi, necrosi & autofagia

La morte cellulare è un processo naturale essenziale per molte funzioni fisiologiche normali sia per lo sviluppo che per l’omeostasi. Inoltre, le alterazioni delle vie di segnalazione della morte cellulare sono associate a varie malattie. La misurazione di singoli segni distintivi delle cellule morenti non è sufficiente per discriminare tra le diverse vie di morte cellulare, che includono apoptosi, necrosi e autofagia; invece, è necessaria una valutazione multiparametrica che includa sia criteri descrittivi che funzionali.

I recenti progressi nella tecnologia permettono ora di approfondire i marcatori molecolari e i cambiamenti cellulari che caratterizzano ogni via di morte cellulare, e hanno anche reso possibile condurre molte di queste analisi come esperimenti di routine da banco. DDW

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Questo articolo è apparso originariamente nel DDW Winter 2014 Issue

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Il dottor John Abrams è professore di biologia cellulare; la sua ricerca esamina le reti molecolari in vivo coinvolte nella regolazione della morte cellulare ed esplora i determinanti dell’organizzazione della cromatina. Si è unito alla University of Texas Southwestern Medical Center nel 1994 ed è diventato presidente del programma di laurea in genetica e sviluppo nel 2004. Il dottor Abrams ha completato il suo dottorato alla Stanford University.

Il dottor William G. Telford è diventato uno scienziato dello staff del National Cancer Institute del National Institutes of Health nel 1999, ed è il direttore del laboratorio centrale di citometria a flusso nel ramo di trapianto e immunologia sperimentale del NCI. Ha ricevuto un dottorato in microbiologia alla Michigan State University e ha completato la formazione post-dottorato in immunologia alla University of Michigan Medical School.

Louise Rollins è product manager presso EMD Millipore Corporation, dove sostiene lo sviluppo del Muse® Cell Analyzer, un citometro a flusso miniaturizzato, e dei suoi kit di analisi e moduli software specifici per le applicazioni per l’analisi di routine della salute e della morte cellulare.