Abstract

Concentrazioni minime inibitorie (MIC) e minime fungicide (MFC) sono state determinate per 38 oli di origine vegetale contro Candida albicans. Quattro ceppi, compreso un ceppo standard, sono stati utilizzati in questo studio. Gli agenti antifungini, il fluconazolo e l’amfotericina B sono stati usati come controlli positivi. Il ceppo standard (ATCC10231) utilizzato in questo studio è risultato essere altamente resistente al fluconazolo: Sono stati necessari 3000 μg ml-1 di fluconazolo per inibire parzialmente la crescita di questo ceppo e non è stato possibile ottenere un’inibizione completa. Altri ceppi di Candida erano sensibili a 5 μg ml-1 di fluconazolo. Tutti i ceppi utilizzati erano sensibili all’amfotericina B. Dei 38 oli testati, 23 sono risultati efficaci e quindici inefficaci. Sulla base dei loro MFC, gli oli efficaci sono stati classificati in tre categorie. Sette oli, che esercitavano un effetto fungicida a meno dello 0,15% di concentrazione di oli, sono stati raggruppati nella classe più efficace. Gli oli che mostravano MFC nell’intervallo di concentrazione 0,16-1,5% sono stati considerati moderatamente efficaci. Nove oli, che richiedevano una concentrazione superiore all’1,5%, sono stati considerati meno efficaci. Il ceppo resistente al fluconazolo (MTCC 227) era sensibile ad almeno 23 degli oli vegetali. I risultati di questo studio indicano che gli oli di origine vegetale possono trovare impiego come potenziali agenti anti-Candida.

1 Introduzione

L’amfotericina B e il fluconazolo sono due importanti agenti utilizzati nella chemioterapia antifungina contro i funghi patogeni umani. L’amfotericina B è usata come farmaco di scelta nei pazienti terminali. Il farmaco azolico, Fluconazolo è ampiamente prescritto contro varie infezioni da Candida albicans. Anche se molto ampiamente acclamato per la loro efficacia, questi farmaci sono noti per avere effetti collaterali. Il fluconazolo è di natura fungistatica e ci sono rapporti di emergenza di resistenza al fluconazolo tra gli isolati clinici di C. albicans. Quindi c’è bisogno di migliori, nuovi agenti antifungini contro le infezioni causate da C. albicans che siano efficaci e abbiano meno effetti collaterali.

Molti agenti naturali come i prodotti vegetali tra cui estratti, oli, ecc sono tradizionalmente utilizzati contro vari disturbi. Alcuni dei prodotti vegetali sono efficaci contro le infezioni fungine e batteriche. Oli essenziali come l’olio dell’albero del tè, l’olio di citronella, l’olio di Palmarosha e alcuni dei loro costituenti sono stati testati contro la crescita in vitro di C. albicans.

Abbiamo testato l’efficacia in vitro di 38 oli vegetali contro quattro isolati di C. albicans. Sono state riportate le concentrazioni minime inibitorie (MIC) e le concentrazioni minime fungicide (MFC) degli oli efficaci. In base alla loro efficacia (MFC), gli oli sono classificati in tre categorie.

2 Materiali e metodi

2.1 Prodotti chimici e ceppi

In questo studio sono stati utilizzati un ceppo standard, il ceppo tipo ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), un ceppo di riferimento suggerito per il dosaggio di amfotericina B, e tre isolati clinici di C. albicans. I tre isolati clinici di C. albicans, cioè SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), sono stati ottenuti dal Centro di raccolta delle colture SRTCC, Scuola di Scienze della Vita, Università SRTM, Nanded (MS). India. Il ceppo standard è stato acquistato da The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, India.

Trentotto oli vegetali sono stati usati in questo studio. Alcuni degli oli sono stati gentilmente forniti dal Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, India, e i restanti oli e i farmaci antifungini, l’amfotericina B e il fluconazolo, sono stati acquistati dal mercato locale.

2.2 Preparazione dell’inoculo

Tutti i ceppi di C. albicans utilizzati in questo studio sono stati coltivati a 30 °C per 24 ore in un incubatore ad agitazione utilizzando un terreno di estratto di lievito peptone e un terreno di destrosio Sabouraud. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione, sospese in acqua distillata sterile e utilizzate immediatamente. Il numero di cellule è stato determinato utilizzando un emocitometro e regolato a 5 × 106 cfu ml-1.

2.3 Screening degli oli vegetali per l’attività anti-Candida mediante test di diffusione del disco

L’attività anti-Candida di 38 oli vegetali è stata testata mediante un test standard di diffusione del disco. Le piastre di Sabouraud Dextrose Agar sono state preparate e seminate con 5 × 106 cfu ml-1 utilizzando gli inoculi di ceppi di Candida preparati come sopra. Asetticamente, 5 μl di oli vegetali sono stati macchiati su dischi di carta da filtro da 5 mm (Whatman n. 1). Questi dischi sono stati poi trasferiti al centro delle piastre seminate. Tre piastre sono state usate per ogni concentrazione e incubate a 30 ± 2 °C. Il diametro della zona di inibizione è stato misurato dopo un’incubazione di 48 ore.

2.4 Determinazione della concentrazione minima inibitoria (MIC) degli oli vegetali con il metodo della diluizione in agar

Le concentrazioni minime inibitorie (MIC) degli oli vegetali sono state determinate mediante il saggio di diluizione in agar (23) Le piastre di agar sono state preparate aggiungendo agar YPD contenente varie concentrazioni di oli vegetali (cioè, 0,03-3% v/v). Tween 20 0,5% (v/v) è stato aggiunto per aumentare la solubilità dell’olio. Queste piastre sono state inoculate con 103 cfu, utilizzando gli inoculi di ceppi di Candida preparati come sopra. Le piastre sono state tenute in triplicato per ogni concentrazione. Le piastre con Tween 20 ma senza olio vegetale sono state usate come controllo. Tutte queste piastre sono state incubate a 30 ± 2 °C. Le piastre sono state osservate e il numero di colonie è stato contato dopo 48 ore di incubazione. I valori MIC sono stati determinati come la più bassa concentrazione di olio che impedisce la crescita visibile dei ceppi di Candida.

2.5 Determinazione della concentrazione minima fungicida (MFC) degli oli vegetali con il metodo della macro diluizione in brodo

La concentrazione minima fungicida (MFC) degli oli vegetali è stata determinata mediante il saggio della macro diluizione in brodo (NCCLS M27-A, metodo di riferimento raccomandato per il test di suscettibilità antifungina del lievito). Una gamma di concentrazioni (0,03-3% v/v) di oli vegetali è stata preparata in brodo YPD in fiasche. Il Tween 80 è stato incluso a una concentrazione finale dello 0,001% (v/v) per migliorare la solubilità dell’olio. Ogni pallone è stato inoculato con 5 × 105 cfu ml-1 dei ceppi di Candida. Le beute contenenti Tween 20 ma prive di olio vegetale sono state usate come controllo. Le beute sono state incubate a 30 ± 2 °C, in un incubatore ad agitazione orbitale (100 rpm) per 48 ore. Da ogni beuta 5 μl di cultura sono stati inoculati su piastre YPD e incubati a 30 ± 2 °C per 48 ore. Le piastre sono state osservate e gli MFC sono stati determinati come la concentrazione più bassa dell’olio vegetale che inibisce completamente la crescita dei ceppi di Candida.

3 Risultati

3.1 Screening degli oli vegetali per l’attività anti-Candida

Gli isolati di C. albicans testati hanno mostrato diverse sensibilità agli oli. Tuttavia, la maggior parte degli oli è stata trovata efficace e ha mostrato una notevole attività a concentrazioni molto basse. Venticinque dei 38 oli testati hanno causato una zona di inibizione di 1-30 mm (ZOI). Diciassette oli hanno causato una ZOI di 10-20 mm. Sei oli hanno mostrato una ZOI di 1-9 mm contro tutti e quattro i ceppi testati. L’olio di gelsomino e di lavanda non è riuscito ad inibire la crescita dei ceppi di Candida, tranne CA IV. (Tabella 1). (13 oli non sono riusciti a inibire la crescita dei ceppi di C. albicans a dosi di 5 μl.)

3.2 Determinazione della MIC degli oli vegetali contro C. albicans

Le MIC dei 23 oli efficaci e di due farmaci ampiamente prescritti, Fluconazolo e Amfotericina B, sono state determinate contro i quattro isolati di C. albicans. Gli oli hanno mostrato un’inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione. In alcuni casi, i ceppi testati hanno mostrato una diversa sensibilità, ma non c’era una differenza considerevole nella MIC (Tabella 2).

Tutti e quattro gli isolati sono risultati sensibili all’amfotericina B. Una concentrazione di 2,5 μg ml-1 di amfotericina B era sufficiente per inibire completamente la crescita del ceppo CAI e del ceppo CA IV (ATCC10231). I ceppi CA II e CA III hanno richiesto 3 μg ml-1 di amfotericina B per l’inibizione totale della crescita (Tabella 2).

La risposta al fluconazolo è stata trovata divergente. Il ceppo Ca III era il più sensibile e solo 2 μg ml-1 di concentrazione di fluconazolo erano sufficienti per una completa inibizione della crescita. I ceppi CA I e CA II richiedevano 5 μg ml-1 di fluconazolo per una completa inibizione della crescita (Tabella 2). Il ceppo CA IV era altamente resistente al fluconazolo: 3000 μg ml-1, cioè 1500 volte la MIC del ceppo CA III, era necessario per una parziale inibizione della crescita. La completa inibizione della crescita non poteva essere raggiunta in questo ceppo anche ad una concentrazione molto alta.

Una concentrazione dello 0,01% di olio di cannella era sufficiente per inibire completamente la crescita di tutti e quattro gli isolati. Gli oli di gelsomino e lavanda hanno causato solo una leggera inibizione della crescita e non sono riusciti a inibire completamente la crescita. Sette oli hanno inibito completamente la crescita dei ceppi di C. albicans all’intervallo di concentrazione di 0,03-0,15%. Per 11 oli la MIC variava da 0,16% a 1,0% Cinque oli richiedevano una concentrazione superiore a 1,0% (tabelle 2 e 3).

3.3 Determinazione della MFC degli oli vegetali contro C. albicans

La concentrazione minima fungicida (MFC) è definita come la più bassa concentrazione di olio che risulta nella morte del 99,9% dell’inoculo. Tutti gli oli che inibiscono la crescita hanno mostrato un’attività fungicida tranne gli oli di gelsomino e lavanda. In generale, è stato osservato che la concentrazione fungicida era superiore al MIC, tranne in alcuni casi come gli oli di menta piperita, geranio, ocimum, chiodi di garofano e gingergrass, che hanno causato la morte del 99,9% dell’inoculo al MIC. Secondo il loro MFC contro ATCC10231, gli oli efficaci potrebbero essere classificati in tre classi. Gli oli che hanno causato un effetto fungicida alla concentrazione dello 0,03-0,15% sono considerati i più efficaci (ME). Gli oli che richiedono una concentrazione dello 0,15-1,0% sono inclusi nel gruppo moderatamente efficace (MoE). Quelli trovati fungicidi a più dell’1,0% di concentrazione sono considerati meno efficaci (LE).

Sette oli sono risultati più efficaci (ME) (Tabelle 2 e 3). L’olio di cannella è stato il migliore, con un effetto fungicida allo 0,03% di concentrazione in tutti e quattro gli isolati di C. albicans. L’olio di chiodi di garofano era fungicida alla concentrazione dello 0,12% e non c’era differenza tra MIC e MFC. Nella maggior parte degli oli ME, per l’effetto fungicida era necessaria una concentrazione di 2-4 volte superiore alla MIC. La risposta degli isolati di Candida ad alcuni membri di questo gruppo era divergente, cioè del ceppo CA II nel caso dell’olio di menta giapponese e dell’olio di Gingergrass, CA III nel caso dell’olio di Lemongrass e CA IV nel caso dell’olio di Ginger grass (tabella 2).

L’olio di menta piperita e l’olio di Tea tree erano i migliori tra il gruppo di sette membri MoE, causando un effetto fungicida alla concentrazione dello 0,25% (tabella 3). L’olio di Tulsi era fungicida alla concentrazione dello 0,5%, l’1% era il MFC degli oli di Canfora, Limone, Ocimum e Ylang-ylang. È stata trovata anche una differenza di sensibilità per alcuni membri di questo gruppo. Due volte la MIC era richiesta per questi oli ad eccezione dell’olio di menta piperita e di Ocimum (tabella 2).

Nove oli sono stati trovati meno efficaci (tabella 3). Questi oli richiedevano più dell’1,0% per esercitare un effetto fungicida. La MFC di questi oli variava dall’1,0% al 3% tranne nel caso dell’olio di gelsomino, zenzero e ginepro, che non erano fungicidi fino alla concentrazione del 3%. CA II e CA III hanno mostrato una sensibilità diversa (Tabelle 2 e 3).

4 Discussione

L’attività anti-candida di alcuni oli essenziali come il Tea tree oil è ben nota. Molti dei preparati utilizzati contro la candidosi vaginale causata da C. albicans contengono il Tea tree oil come componente attivo. Diversi oli di origine vegetale sono stati suggeriti nelle medicine alternative contro le infezioni microbiche tra cui la candidosi e la gengivite. Tuttavia, gli agenti antimicotici azolici e derivati continuano a dominare come farmaci di scelta contro le infezioni da Candida, come applicazioni topiche o come farmaci orali. Ad eccezione del Tea tree oil, che ha una storia di oltre 80 anni di utilizzo in Australia, non molti prodotti a base di erbe sono entrati nel mercato. Alcuni prodotti contenenti olio di rosmarino sono usati contro i funghi che causano la forfora. In vitro l’attività anti-Candida di oli essenziali come Tea tree, Lemongrass, Citronella, Peppermint e Palmarosa sono stati riportati. Abbiamo esaminato l’efficacia di 38 oli di origine vegetale per l’attività anti-Candida in vitro contro quattro isolati di C. albicans (Tabelle 1 e 2). Almeno 23 degli oli testati si sono dimostrati promettenti come agenti efficaci. Questi oli potevano essere classificati secondo la loro efficacia (tabella 3). Uno degli isolati che è risultato resistente al fluconazolo è stato inibito a concentrazioni molto basse di tutti gli oli efficaci di origine vegetale testati in questo studio (Tabella 2).

Il test di diffusione a disco è un metodo standard ampiamente utilizzato per lo screening rapido dei prodotti naturali per l’attività antifungina. Abbiamo esaminato gli oli vegetali utilizzando questo metodo di analisi molto conveniente. Questo studio indica che la cautela è necessaria in quanto diversi oli possono avere diverse velocità di diffusione su piastre di agar e questo può contribuire alla variazione delle zone inibitorie, portando a conclusioni errate per quanto riguarda la loro attività antifungina. Per esempio, alcuni degli oli che hanno mostrato zone di inibizione più piccole rispetto ad altri erano molto efficaci contro i ceppi di Candida nel test di diluizione in brodo NCCLS che non comporta la diffusione. Per esempio, l’olio di cannella ha mostrato una ZOI di 24 mm nel test di diffusione del disco, mentre l’olio di citronella ha mostrato 30 mm. Ma nel test MFC l’olio di cannella (0,01%) è risultato migliore dell’olio di citronella (0,06%). L’attività fungicida è considerata una qualità desiderabile per gli agenti antifungini, poiché potrebbe eliminare totalmente il fungo dai tessuti. L’amfotericina B è fungicida, è nota per essere molto efficace contro i funghi patogeni umani ed è usata come farmaco di scelta nelle infezioni fungine sistemiche, nonostante i suoi gravi effetti collaterali. Il fluconazolo, l’agente antifungino ampiamente prescritto contro le infezioni da Candida, è di natura fungistatica e può richiedere un uso prolungato.

È incoraggiante notare che la maggior parte degli oli usati in questo studio erano fungicidi a basse concentrazioni. Non sono disponibili molte informazioni sulla modalità d’azione dei prodotti naturali che inibiscono la crescita della Candida. Altri ceppi resistenti al fluconazolo/azolo devono essere inclusi in studi futuri. Gli oli vegetali potrebbero essere utilizzati come agenti anti-Candida contro i ceppi resistenti agli azoli. La maggior parte degli oli usati in questo studio hanno una lunga storia di utilizzo in campo alimentare, dolciario e come componenti di profumi. Tuttavia, se devono essere considerati in preparazioni topiche, deve essere intrapresa un’attenta esplorazione dei loro probabili effetti irritanti e di altri effetti indesiderati negli esseri umani.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati al Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) India, per l’incoraggiamento.

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