Discussione

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che MR e GR sono presenti nella corteccia surrenale del ratto. Abbiamo dimostrato che l’alterazione dell’attività del MR regola la produzione di aldosterone nella ZG in un modo che si adatta a un meccanismo di feedback negativo. Questo effetto è specifico per il MR, poiché la modulazione dell’attività del GR nella ZG non ha avuto alcun effetto sulla produzione di aldosterone. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che l’espressione del MR e il suo ruolo nella regolazione della secrezione di aldosterone nella corteccia surrenale sono stati riportati. Nella ZF/ZR, abbiamo osservato un ciclo di feedback simile quando abbiamo modificato farmacologicamente l’attività della GR. È interessante notare che l’attivazione del GR ha anche soppresso la secrezione di corticosterone nelle cellule ZF/ZR. I nostri risultati sono in accordo con studi precedenti che mostrano che la sintesi di glucocorticoidi surrenali può essere modulata da steroidi sintetizzati all’interno della corteccia surrenale (Baird et al. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).

L’attivazione del MR con FLUDRO ha esercitato un effetto negativo sulla produzione di aldosterone nelle cellule ZG preparate da ratti mantenuti con entrambe le diete HS e LS, mentre l’acido canrenoico, un antagonista MR, ha regolato positivamente la steroidogenesi con un aumento della secrezione di aldosterone nelle cellule ZG da ratti alimentati LS. Abbiamo visto una risposta più pronunciata nei gruppi LS rispetto a quella dei gruppi HS. La mancanza di effetto di un agonista GR e di un antagonista sul rilascio basale e stimolato di aldosterone dalle cellule ZG è altamente indicativo del fatto che il ciclo di feedback regolatorio è specifico del recettore.

Quale potrebbe essere la rilevanza fisiologica e clinica di un ciclo di feedback ultra-corto di aldosterone? Esiste una stretta relazione tra la produzione di aldosterone e i fattori ambientali, ad esempio l’assunzione di sodio e potassio, la postura, l’ora del giorno e la perdita di volume. È stato stabilito da tempo che livelli inappropriati di aldosterone, per il livello di questi fattori ambientali, portano a una varietà di malattie cardiovascolari e metaboliche nell’uomo e in altri animali. Pertanto, i cicli di feedback negativo criticamente sensibili sono importanti per il mantenimento della normale omeostasi. Ciò è particolarmente rilevante per l’omeostasi volume/sodio, poiché anche un piccolo disallineamento delle risposte ai cambiamenti nell’assunzione ambientale di sodio nel tempo può portare a sostanziali effetti cardiovascolari avversi. Queste potenziali conseguenze sono probabilmente il motivo per cui ci sono diversi controlli ed equilibri nei sistemi che regolano l’omeostasi di volume/sodio, ad esempio il sistema renina-angiotensina, l’aldosterone, i peptidi natriuretici, l’endotelina, la vasopressina e il rene (flusso sanguigno renale, tubulo prossimale, ciclo di Henle e tubulo distale/dotto collettore). Questi fattori di regolazione sono controllati, in parte, da: (1) anelli di feedback negativi “lunghi”, ad esempio, anello di feedback negativo volume-renina-angiotensina-aldosterone; (2) direzione dell’azione di fattori ad azione opposta, ad esempio, peptidi natriuretici che sopprimono la secrezione di aldosterone e (3) anelli di feedback ultracorti, ad esempio, soppressione diretta del rilascio di renina dall’apparato juxtaglomerulare mediante interazione dell’angiotensina II con il recettore dell’angiotensina di tipo 1. Per alcuni aspetti, le funzioni dei cicli di feedback ultracorti sono analoghe al concetto quasi universale di inibizione del prodotto della funzione enzimatica. Parallelamente all’effetto dell’angiotensina II, lo studio attuale sostiene l’ipotesi che esista anche un ciclo di feedback ultracorto che modifica la produzione di aldosterone nel suo punto di sintesi finale utilizzando il livello di aldosterone e il MR. Questo passaggio perfeziona ulteriormente la produzione di aldosterone per garantire che sia appropriato per l’ambiente in cui l’organismo risiede attualmente. Naturalmente, fornisce anche un altro punto in questi meccanismi omeostatici del volume in cui la disfunzione può portare a disfunzioni e malattie cardiovascolari. Due rapporti sono potenzialmente rilevanti per queste possibilità. In contrasto con i presenti studi in cellule ZG normali dove la RU 486 non ha avuto alcun effetto sulla secrezione di aldosterone, in due condizioni alterate, cellule tumorali primarie di aldosterone (Burton et al. 2011) e ratti obesi ipertesi Zucker (Clapham & Turner 1997), la RU 486 ha soppresso i livelli plasmatici di aldosterone ma non di corticosterone. Simile al presente studio, la RU 486 non ha alterato i livelli di aldosterone nei ratti di controllo (Clapham & Turner 1997). È interessante notare che nelle cellule tumorali, gli antagonisti MR non hanno avuto alcun effetto sulla produzione di aldosterone. L’attivazione del MR non è stata eseguita. Poiché nelle preparazioni cellulari sono stati trovati livelli simili di aldosterone e cortisolo, era presente una commistione cellulare o un tipo cellulare alterato (Burton et al. 2011). Infine, i risultati del presente studio possono essere applicabili alla regolazione degli steroidi al di fuori del surrene con la loro probabile rilevanza fisiologica e clinica.

Come i cambiamenti nell’attività del MR modificano la secrezione di aldosterone? L’aumento della secrezione di corticosterone con una concomitante soppressione della produzione di aldosterone suggerisce che la via tardiva della biosintesi dell’aldosterone è il sito di regolazione. L’ultima fase della sintesi dell’aldosterone si basa sull’attività del CYP11B2 (aldosterone sintasi) (Mornet et al. 1989). La diminuzione della conversione del corticosterone in aldosterone è molto probabilmente dovuta alla diminuzione dell’attività del CYP11B2 e non a un cambiamento nell’espressione del CYP11B2 a causa della breve (1 ora) durata dei nostri esperimenti. La nostra scoperta di una diminuzione dei livelli di proteina CYP11B2 in condizioni di HS e il meccanismo proposto di modifica dell’attività CYP11B2 da MR probabilmente spiega l’attenuazione del ciclo di feedback di regolazione su una dieta ad alto contenuto di sale.

L’assunzione di sodio basso è un noto stimolatore della secrezione di aldosterone (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), e i nostri risultati sono in linea con questi rapporti. Abbiamo osservato un aumento del corticosterone sierico con una dieta ad alto contenuto di sale. Coerentemente con un aumento del corticosterone nel siero, le cellule ZF/ZR isolate dai ratti con una dieta ad alto contenuto di sale hanno mostrato una maggiore secrezione basale di corticosterone. I meccanismi con cui il sodio alimentare influisce sulla secrezione di corticosterone non sono stati studiati, anche se studi precedenti hanno dimostrato che le surrenali di ratti carenti di sodio hanno una ridotta secrezione di corticosterone (Eisenstein & Strack 1961). Il corticosterone può essere prodotto sia dalle ZF/ZR che dalle ZG, anche se la maggior parte del corticosterone circolante proviene dalle ZF/ZR a causa della loro massa sostanzialmente maggiore. Tuttavia, poiché il rilascio basale di corticosterone dalle cellule ZG non è stato influenzato dai cambiamenti nell’assunzione di sodio nella dieta, abbiamo dedotto che le cellule ZF/ZR hanno contribuito all’aumento del corticosterone nel siero con un’elevata assunzione di sodio.

L’esistenza di un ciclo di feedback intra-adrenale esercitato da glucocorticoidi e GR per regolare la produzione di glucocorticoidi è stato a lungo suggerito da diversi studi in vivo (Peron et al. 1960, Hill & Singer 1968) e in vitro (Morrow et al. 1967, Carsia & Malamed 1983). Questi studi riportano risultati contrastanti sul fatto che i glucocorticoidi inibiscano o stimolino la produzione di glucocorticoidi. La direzione della regolazione sembra dipendere dal modello sperimentale utilizzato e dalla durata del trattamento. In questo studio, forniamo la prova di un feedback negativo di regolazione sulla secrezione di corticosterone coerente con i risultati di Carsia & Malamed (1983), anche se altri ricercatori hanno riportato risultati opposti (Darbeida & Durand 1987, Li et al. 2011, Asser et al. 2014). Nonostante l’ampio corpo di lavoro, i meccanismi attraverso i quali i glucocorticoidi regolano la steroidogenesi non sono ben compresi. I nostri risultati che mostrano una marcata depressione nella secrezione di corticosterone solo nelle cellule ZF/ZR stimolate da ACTH con il trattamento DEX sono in accordo con i risultati di Latner e colleghi (Latner et al. 1977), che suggeriscono che i glucocorticoidi diminuiscono il legame di ACTH al suo recettore. Inoltre, l’antagonista dei glucocorticoidi, RU 486 non ha influenzato la secrezione basale di corticosterone ma ha stimolato la produzione di corticosterone da parte dell’ACTH. Questi dati indicano la possibilità che l’attività GR modifichi la sensibilità delle cellule ZF/ZR all’ACTH. Altri lavori che utilizzano tempi di incubazione più lunghi suggeriscono che i glucocorticoidi inibiscono la sintesi proteica e regolano la trascrizione su diversi geni bersaglio nella corteccia surrenale (Morrow et al. 1967, Asser et al. 2014). Anche se questa spiegazione sembra improbabile nel nostro studio a causa della durata dei nostri esperimenti, non possiamo escludere la possibilità che gli effetti genomici potrebbero aver contribuito alle nostre osservazioni.

Una scoperta sorprendente nel nostro studio era che la ZF/ZR in contrasto con la ZG non dimostra la specificità del recettore. L’attivazione del GR o del MR può sopprimere la produzione di corticosterone nella ZF/ZR. L’attivazione del MR è stata riportata per modulare la produzione di glucocorticoidi, ma questo effetto è dimostrato solo nel cervello. La somministrazione di fludrocortisone nell’uomo è stata trovata per inibire le concentrazioni di cortisolo attraverso la downregulation dell’asse ipotalamo-ipofisario (HPA) (Otte et al. 2003, Buckley et al. 2007, Lembke et al. 2013). La chiara influenza di MR nel controllo di feedback di glucocorticoidi HPA è stato ulteriormente dimostrato quando l’acido canrenoico ha dimostrato di avere un effetto opposto sulla secrezione di cortisolo e ACTH (Arvat et al. 2001, Wellhoener et al. 2004). I nostri risultati suggeriscono che oltre a MR attività centralmente regolando la produzione di glucocorticoidi, può anche regolare localmente nel surrene, anche se la regolazione apparentemente dipende dal livello di assunzione di sale. Su entrambe le diete in risposta a ACTH, attivazione MR inibisce la produzione di corticosterone, ma, per ragioni non chiare, sulla dieta a basso contenuto di sale sembra aumentare i livelli di corticosterone. Dato che in vivo il flusso sanguigno surrenale è dalla ZG alla ZF/ZR, l’aldosterone potrebbe avere effetto paracrino sulla produzione di glucocorticoidi con interessanti implicazioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Un limite dello studio era che la contaminazione tra le zone glomerulosa e fasciculata potrebbe potenzialmente oscurare i cambiamenti in risposta a stimoli diversi. Pensiamo che questo sia improbabile sulla base dell’assenza di CYP11B2 nella ZF/ZR e i dati microscopici, dove le cellule ZF/ZR e ZG hanno caratteristiche nettamente diverse, hanno mostrato poca o nessuna contaminazione nei due prelievi cellulari. Una seconda limitazione è che il presente studio non può valutare l’importanza relativa di questi effetti paracrini rispetto ai classici effetti endocrini che controllano la steroidogenesi surrenale. Una terza limitazione è che non sappiamo se il cortisolo o il corticosterone interagendo con il MR può avere lo stesso effetto dell’aldosterone. Tuttavia, come menzionato in precedenza, data la direzione del flusso sanguigno dalle zone glomerulosa a fasciculata, se si verificasse non sarebbe un effetto locale, paracrino. In quarto luogo, non possiamo escludere la possibilità di cross-reattività tra l’agonista e l’antagonista MR con GR. Anche se il fludrocortisone è noto per esercitare una certa attività glucocorticoide, la sua affinità per il MR è 15 volte superiore a quella per la GR (Agarwal et al. 1977). Non ci sono stati rapporti che conosciamo riguardo all’interazione dell’acido canrenoico con i GR a qualsiasi dose. Quinto, quando non abbiamo visto un effetto di una manipolazione sulla produzione basale di steroidi, non possiamo concludere con certezza che non ce n’è uno, perché un’interpretazione altrettanto plausibile sarebbe che i nostri sistemi di analisi non sono abbastanza sensibili per cogliere piccoli effetti. Infine, l’estrapolazione di questi studi sui ratti agli esseri umani è incerta.

In conclusione, oltre ai classici, lunghi cicli di feedback che regolano la produzione di steroidi surrenali, il presente studio supporta l’ipotesi che ci siano cicli di regolazione negativi ultra-corti mediati specificamente da MR sulla secrezione di aldosterone e GR sulla produzione di corticosterone in cellule isolate ZG e ZF/ZR, rispettivamente. Riportiamo qui la scoperta inaspettata che l’attivazione di MR regola negativamente anche la secrezione di glucocorticoidi nelle cellule ZF/ZR. Come questi brevi cicli di feedback interagiscano con i loro lunghi cicli di feedback è incerto. Tuttavia, questi risultati sollevano domande intriganti per quanto riguarda la regolazione fisiologica e la potenziale disregolazione fisiopatologica della produzione di questi steroidi.