3.53.4.3 Synthetische faagtherapie

Bacteriofagen, of kortweg fagen genoemd, hebben een centrale rol gespeeld in de ontwikkeling van de moleculaire biologie, de bacteriële genetica en het leveren van de vroegste gereedschappen voor het recombineren van DNA-moleculen, zoals restrictie-enzymen en ligasen. In het afgelopen decennium heeft de studie van resistentiemechanismen van fagen geleid tot de ontdekking van een van de belangrijkste technologieën voor SB sinds de PCR, namelijk de CRISPR-nuclease-systemen, die bacteriën en archaea hebben ontwikkeld als een adaptieve verdediging tegen exogeen DNA. De recente identificatie van talrijke andere nog niet eerder gekarakteriseerde antifaagsystemen kan nog meer baanbrekende technologieën voor SB-toepassingen opleveren.45 In deze historische context is het dan ook passend dat SB nu wordt toegepast op fagen om hun gebruik als therapeutische middelen te perfectioneren.

Fagen werden onafhankelijk van elkaar ontdekt door Frederik Twort en Félix D’Hérelle in het begin van de 20e eeuw46,47 en werden spoedig daarna gebruikt als antimicrobiologische middelen voor de behandeling van infectieziekten zoals cholera en pest. In Oost-Europa werd faagtherapie gemeengoed en tot op heden bestaan er verschillende gerenommeerde behandelingscentra, bijvoorbeeld in Georgië en Polen. In het Westen werd faagtherapie, na enkele sporadische eerste successen, minder gebruikt toen antibiotica algemeen beschikbaar werden. Vandaag, met de opkomst van antimicrobieel resistente pathogenen, aanvankelijk de zogenaamde ESKAPE-stammen48 maar nu een nog bredere reeks pathogenen49 waarvan wordt voorspeld dat zij tegen 2050 meer doden dan kanker zullen veroorzaken, is er een hernieuwde belangstelling voor faagtherapie.

Het gebruik van fagen heeft verschillende voordelen ten opzichte van antibiotica, in de eerste plaats de mogelijkheid om specifieke stammen aan te pakken en daarbij de nuttige microbiële gemeenschap intact te laten, en ook de mogelijkheid om resistentie te overwinnen door het gebruik van complementaire fagencocktails, het ’trainen’ van fagen op geselecteerde gastheerstammen of eenvoudigweg het isoleren van nieuwe fagen tegen een pathogeen. Omgekeerd zijn er verschillende hindernissen te overwinnen en gebieden voor verbetering om faagtherapie tot een betrouwbaar geneesmiddel te maken en op grote schaal in het Westen ingang te doen vinden, zoals; sterke klinische proeven met goede controles, verkorting van de tijd voor het identificeren van fagen met het geschikte gastheerbereik, het overwinnen van faagresistentie en uitsluitingsmechanismen van de doelstam zonder de noodzaak van complexe cocktails, het omzeilen van ongewenste immuunreacties op de faagdeeltjes en beheersing van gegeneraliseerde transductie van antibioticaresistentiegenen of bacteriële virulentiefactoren. Zelfs in het geval van succesvolle doding van een doelstam, kan de snelle lysis van een groot aantal bacteriën en het gelijktijdig vrijkomen van endotoxinen en superantigenen resulteren in een sterke ontstekingsreactie en een ongunstige klinische uitkomst.

De zeer modulaire organisatie van faaggenomen en de assemblage van de faagstructuur als functionele modules, zoals staartvezels, spikes, staartbuizen en capsid, maakt fagen ideale doelwitten voor SB-benaderingen, in zekere zin zijn faaggenomen reeds georganiseerd in BioBricks. In een vroeg sjabloon voor toekomstig synthetisch faagontwerp werd de filamenteuze faag Pf3 gemodificeerd om Pseudomonas aeruginosa infectie in een muismodel te behandelen.50 Een exportproteïnegen van Pf3 werd vervangen door een gen dat codeert voor het BglII restrictie-endonuclease, met de redenering dat (1) deze genvervanging Pf3 niet-replicatief maakt en zo een beheersingsstrategie introduceert, (2) de faag stabiel kan worden vermeerderd in een gastheer die het BglII methylasegen bevat en (3) de BglII dubbele strengbreuken zou katalyseren in het genomische DNA van de doelstam om deze te doden. Een belangrijke bevinding van deze studie was dat behandeling van geïnfecteerde muizen met het gemanipuleerde faag Pf3R of met een lytische faag een vergelijkbare overlevingskans gaf voor muizen die werden uitgedaagd met een minimale dodelijke dosis van 3, maar bij een minimale dodelijke dosis van 5 was de overlevingskans significant beter met Pf3R faagtherapie. Analyse van serum cytokine niveaus gaf een verminderde ontstekingsreactie aan, wat aangeeft dat het betere resultaat voor de Pf3R behandelingsgroep te wijten is aan het efficiënt doden van de doelstam zonder lysis en het vrijkomen van endotoxine.

Het doden van P. aeruginosa door Pf3R is afhankelijk van het faaggastheerbereik om specificiteit van targeting te bieden, aangezien verwacht wordt dat BglII restrictieplaatsen in vrijwel alle bacteriële genomen aanwezig zijn. Een verbetering wordt gesuggereerd door de opmerkelijke ontdekking van een bacteriofaag die een CRISPR/Cas-systeem, afkomstig van een onbekende bron, voor eigen gebruik heeft verkregen.51 Het door de faag gecodeerde CRISPR/Cas-systeem is in staat om nieuwe spacers te verwerven en het CAS3-nuclease is opnieuw gericht op een chromosomaal element dat zijn gastheer, Vibrio cholera, gebruikt voor aangeboren immuniteit. Na deze ontdekking werd het type II CRISPR-systeem van Streptococcus pyogenes ingebouwd in M13 bacteriofaag met afstandhouders om zich te richten op sequenties voor antibioticaresistentie en virulentiegenen in Escherichia coli, waarbij de auteurs deze hulpmiddelen RNA-geleide nucleasen (RGN’s) noemen.52 Een RGN was in staat om een stam met een enkel nucleotidepolymorfisme in DNA-gyrase, dat quinolonresistentie oplevert, op discriminerende wijze te doden. In een kunstmatig consortium van drie bacteriestammen konden zij geselecteerde stammen doden (400-20.000 keer meer dan in de controlegroep), terwijl de andere leden van het consortium intact werden gelaten. De specificiteit van CRISPR/Cas-gemedieerde doding kan faagtherapie uitbreiden van pathogenen tot precieze modulatie van menselijke microbiomen, waarvan de samenstelling betrokken is bij de prognose van sommige kankers en zelfs neurologische aandoeningen zoals autisme, Parkinsons en Alzheimers via de darm-hersenas.

Een ideaal synthetisch faagplatform zou er een kunnen zijn waarin de binding aan de gastheer zo is gemanipuleerd dat deze zeer breed is, terwijl de specificiteit van stammen targeting wordt geleverd door de CRISPR/Cas payload. Op deze manier kunnen fagen gemakkelijk worden ingezet voor behandelingen, zonder dat voor elke ziekteverwekker ad hoc een nieuw platform moet worden geïsoleerd. Voorts zou het brede gastheerbereik in combinatie met CRISPR-arrays gericht tegen verschillende antibioticaresistentie- of virulentiegenen het gebruik van presumptieve faagtherapie mogelijk kunnen maken, d.w.z. voordat de ziekteverwekker is geïdentificeerd. Strategieën om het gastheerbereik uit te breiden omvatten voorwaartse genetische screening om faagreceptoren en vereiste gastheerfactoren te identificeren,53 mining van prophage receptor bindende proteïne (RBP) sequenties uit bacteriële genomen en rebooting van synthetische fagen die bijvoorbeeld receptor bindende proteïne RBP bibliotheken kunnen coderen voor HTS.54,55 Het maskeren van receptoren door capsules kan overwonnen worden door expressie van exopolysaccharide hydrolyserende enzymen56 en andere enzymen om biofilms af te breken57 , terwijl andere maskeermechanismen en fasevariatie in receptorexpressie overwonnen kunnen worden door fagen gemanipuleerd met verschillende staartvezels die verschillende RBP’s bevatten of RBP’s naar niet-canonieke hoog geconserveerde celoppervlak targets. Bacteriën maken gebruik van tal van anti-phage systemen, waarvan de belangrijkste de aangeboren immuniteit van restrictie-modificatie en de adaptieve immuniteit van CRISPR / CAS zijn, maar omgekeerd hebben fagen ook meerdere strategieën ontwikkeld om deze systemen te verslaan, zoals het gebruik van niet-kanonieke nucleotiden in hun DNA, het hebben van minder restrictieplaatsen of hypermethylering van hun genomen en het leveren van eiwitten die restrictie-enzymen remmen of methylerende enzymen van de gastheer versterken.

Het hier beschreven synthetische faagplatform zou de behoefte aan faagcocktails, waarvoor de wettelijke goedkeuring complexer kan zijn, overbodig maken. Overblijvende doelstellingen voor faagtechniek zijn generiek voor vele biologische geneesmiddelen, zoals stabiliteit en reactie van het immuunsysteem. Met name fagocyterende cellen zijn verantwoordelijk voor het opruimen van faagdeeltjes uit het bloedvatenstelsel. Langcirculerende faagmutanten werden verkregen door een seriële passagetechniek58 en bleken gemuteerd te zijn in het voornaamste capside-eiwit. Later resulteerde een enkele aminozuurverandering, ook in een capsidine-eiwit, door directe genetische manipulatie in een 13.000 tot 16.000 maal verhoogde capaciteit van de faag om in de bloedsomloop van de muis te blijven.59 Andere parameters om fagen als therapeutische agentia te verbeteren, zoals productie, formulering en toedieningsweg vallen waarschijnlijk buiten het bereik van SB activiteiten, maar de lessen die geleerd zijn uit eerder werk met inheemse fagen zullen ook van toepassing zijn op SB gemanipuleerde fagen.

Over het laatste decennium met de hernieuwde belangstelling voor faagtherapie en sporadische meldingen van succesvolle individuele patiënten gevallen zijn er pogingen geweest om gecontroleerde klinische trials uit te voeren, hetgeen heeft geresulteerd in geen significante nadelige effecten, maar werkzaamheid nog steeds niet nadrukkelijk aangetoond. Het zal een opwindend volgend artikel zijn in het faagtherapieverhaal, dat meer dan 100 jaar geleden begon, om te zien hoe SB gemanipuleerde fagen klinische proeven zullen ingaan.