Abstract

We onderzochten de effecten van behandeling met vanadiumsulfaat (VOSO4) aan 5 en 10 mg/kg gedurende 30 dagen op de endocriene pancreasactiviteit en histologie bij niet-diabetische en STZ-geïnduceerde diabetische ratten. In de diabetische groep steeg de bloedglucosespiegel aanzienlijk, terwijl de insulinemie duidelijk afnam. Aan het einde van de behandeling normaliseerde VOSO4 in een dosis van 10 mg/Kg de bloedglucosespiegel in de diabetische groep, herstelde de insulinemie, en verbeterde de insulinegevoeligheid aanzienlijk. VOSO4 verhoogde ook op een dosis-afhankelijke manier het aantal insuline-immunopositieve bètacellen in pancreaseilandjes van niet-diabetische ratten. Bovendien werd in de STZ-diabetische groep de afname van het aantal insuline-immunopositieve bètacellen gecorrigeerd om het controleniveau te bereiken, voornamelijk met de hogere dosis vanadium. Daarom normaliseerde VOSO4 behandeling de plasma glucose en insuline niveaus en verbeterde de insuline gevoeligheid bij STZ-experimentele diabetes en induceerde het beta cellen proliferatie en/of regeneratie in normale of diabetische ratten.

1. Inleiding

Vanadium is een overgangsmetaal. Geschat wordt dat meer dan 60 duizend ton van dit element elk jaar in de atmosfeer wordt uitgestoten als gevolg van menselijke activiteiten, voornamelijk door de verbranding van fossiele brandstoffen.

Nadat ze in de bloedsomloop terechtkomen via het maagdarmkanaal of de luchtwegen, worden vanadiumverbindingen getransporteerd door transferrine of, minder vaak, door albumine of laagmoleculaire componenten van plasma, zoals citraten en, in mindere mate, lactaten of fosfaten. Er zijn veel studies uitgevoerd naar anorganische en organische vanadiumderivaten in geïnduceerde diabetespopulatiemodellen, waarbij de bestudeerde verbindingen een effect bleken te hebben op de glucose-, cholesterol- en triglyceridengehalten, zonder significante schadelijke bijwerkingen bij langdurige toediening. Veel experimenten werden ook uitgevoerd bij diabetespatiënten, waarbij het therapeutische effect van vanadiumverbindingen op de bloedglucosespiegel werd bevestigd met weinig toxische effecten .

Vanadium (inclusief vanadyl en vanadaat) is aangetoond dat het de bloedglucosespiegel verlaagt door glycogenese, glucose-opname en metabolisme te stimuleren en door glucosevorming via levergluconeogenese en glycogenolyse te remmen . Gebleken is dat vanadium en vanadiumverbindingen een insulineachtige activiteit vertonen door de werking van insuline via de activering van de insuline-receptor tyrosinekinase en de cascade van kinasefosforylering na te bootsen. Daarom is vanadylsulfaat voorgesteld als een therapeutisch middel voor de behandeling van type 1 diabetes. Streptozotocine (STZ) behandeling vernietigt de beta insuline-producerende cellen van de pancreas en STZ-geïnduceerde diabetische ratten worden beschouwd als een model van type 1 diabetes mellitus . Hoewel aangetoond werd dat vanadiumverbindingen antidiabetische eigenschappen hebben in STZ-geïnduceerd diabetisch model, wordt het mechanisme van hun acties momenteel nog onderzocht. Het doel van deze studie was om de responsen te onderzoeken van 30 dagen behandeling met vanadiumsulfaat bij niet-diabetische en STZ-geïnduceerde diabetische ratten.

2. Materialen en Methoden

2.1. Voorbereiding van diabetische ratten

De dieren werden diabetisch gemaakt door een intraperitoneale injectie (ip) van STZ in een enkele dosis van 65 mg/Kg in 0,01 M citraatbuffer (pH 4,5). Deze ip-methode werd gekozen op basis van recente rapporten die een uitgesproken glucoseverhogend effect aantoonden bij STZ-diabetische ratten. Dieren en behandeling

Mannelijke Wistar ratten, 5-6 weken oud (gewicht 175-200 g), werden aangekocht bij het Pasteur Instituut van Tunesië en gebruikt in overeenstemming met de Lokale Ethische Commissie van de Universiteit van Tunis voor het gebruik en de verzorging van dieren in overeenstemming met de NIH aanbevelingen. Ze werden voorzien van voedsel (standaard pellet dieet-Badr Utique-TN) en water ad libitum en gehuisvest vijf per kooi onder verzamelde temperatuur (22 ° C) met een 12-uurs licht-donkercyclus. De ratten werden verdeeld in zes groepen.

Groep 1 waren niet-diabetische controledieren (ND controle) en kregen dagelijks een intraperitoneale injectie (ip) van NaCl 9. Groep 2 en 3 waren ND en kregen dagelijks een dosis van 5 of 10 mg VOSO4/Kg, respectievelijk (ND + 5 mg/Kg en ND + 10 mg/Kg), gedurende 30 dagen. Groep 4 was een diabetische controle (D controle) geïnjecteerd met een eenmalige dosis van 65 mg/Kg STZ. De groepen 5 en 6 bestonden uit STZ-diabetische dieren die gedurende 30 dagen werden behandeld met respectievelijk 5 of 10 mg/Kg VOSO4 (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). STZ-groepen werden behandeld met VOSO4 na 48 uur van STZ-geïnduceerde diabetes.

2.3. Biochemische analyses

Alle dieren werden 12 uur nuchter gehouden alvorens de glycemie te bepalen met een glucometer (ACCU-CHEK-Active Roche). De insulinegevoeligheid werd gemeten na ip injectie van 1 U/Kg insuline en de bloedglucosespiegels werden bepaald met intervallen van 30 min gedurende 2 uur als het percentage van de hormoonspiegel op .

De dieren werden na 24 uur van de laatste behandeling opgeofferd en het bloed werd verzameld en het serum werd verwerkt voor de schatting van insuline die werd bepaald door Elisa kit (gedistribueerd door BioVendor).

2.4. Immunohistochemische evaluatie

Immunohistochemische kleuring van insuline werd uitgevoerd om de integriteit van beta cellen in Langerhans eilandjes te karakteriseren. Hiervoor werden weefseldoorsneden met het grootste oppervlak van de eilandjes van Langerhans geselecteerd voor vergelijkingen tussen groepen. Secties werden eerst ontvet, gehydrateerd door een afnemende geleidelijke ethanolreeks, ondergedompeld in tampon citraat (pH 6) gedurende 40 min, en vervolgens geïncubeerd met een polyklonaal Guinea varken anti-insuline antilichaam verdund in 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Na het wassen werden de coupes geïncubeerd met fosfatasegeconjugeerd anti-Guineavarkenantilichaam en werd de procedure van revelatie ondersteund door de TechMate 500-machine. Tenslotte werden de secties gekleurd met hematoxyline/eosine.

Tien pancreaseilandjes per rat werden onder de microscoop onderzocht en het aantal insuline-positieve en insuline-negatieve cellen werd geteld door hun kernen te nummeren. De gegevens worden uitgedrukt als het percentage insuline-immunopositieve cellen/totaal aantal cellen in elk eilandje.

2.5. Statistische analyse

De significantie van de verschillen tussen de verschillende groepen werd geëvalueerd door een eenwegs variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey’s Meervoudige Vergelijkingstest, en de waarde werd als significant op niveau.

3. Resultaten

Het effect van VOSO4 behandeling op de bloedglucosespiegels bij nondiabetische (ND) en diabetische (D) ratten wordt getoond in figuur 1. Er waren geen significante veranderingen in de bloedglucosespiegels in de controle ND groep tijdens de behandeling (figuur 1(a)). Behandeling van ND ratten met VOSO4 bij 5 of 10 mg/Kg veranderde de bloedglucosespiegels niet significant gedurende de eerste 10 dagen. De bloedglucosespiegel daalde echter aanzienlijk aan het einde van de behandeling met de dosis van 5 mg/Kg en werd aanzienlijk verlaagd van 15 tot 30 dagen met de dosis van 10 mg/Kg in vergelijking met de controle ND groep. Op dag 30 was de daling van de glycemie ongeveer 8 en 15%, respectievelijk, voor de doses van 5 en 10 mg/Kg in vergelijking met de controlegroep. Zoals vermoed, werd een opmerkelijke stijging van de bloedglucosespiegel waargenomen bij de met STZ behandelde controle ratten in vergelijking met onbehandelde dieren ( versus mg/dL) hetgeen wijst op een diabetes installatie die gedurende het gehele experiment gehandhaafd bleef. Behandeling van de diabetische groep (D) met 5 mg/Kg VOSO4 verlaagde de bloedglucosespiegel aanzienlijk vanaf dag 10, terwijl een dosis van 10 mg/Kg de bloedglucosespiegel aanzienlijk en geleidelijk verlaagde vanaf dag 5 om een normaal niveau te bereiken op dag 30. De genoteerde waarden van glycemie op 30 dagen waren en versus mg/dL, respectievelijk, in D + 5, D + 10, en controle D groepen (figuur 1(b)).

Tabel 1 toonde de niveaus van insuline in ND en D groepen zonder en na VOSO4 behandeling. De ND ratten behandeld met 5 mg/Kg VOSO4 vertoonden geen significante veranderingen in insulinemie niveau, maar een duidelijke toename werd verkregen met 10 mg/Kg vergeleken met de controle ND groep ( versus µg/L). Bovendien was in de controle D groep de insulinemie sterk verlaagd in vergelijking met de controle ND dieren ( versus µg/L). Toediening van VOSO4 in de D-groepen verhoogde de insulinemie duidelijk op een dosis-afhankelijke manier. In feite werden de insulinegehaltes bij diabetische ratten verhoogd van tot en µg/L met, respectievelijk, 5 mg en 10 mg/Kg doses.

Veranderingen in de insulinegevoeligheid na ip injectie van insuline (1 U/Kg) bij normale en met diabetici behandelde dieren worden getoond in figuur 2. Bij ND ratten veranderde de behandeling met 10 of 5 mg VOSO4 het glycemie profiel in reactie op insuline toediening niet (figuur 2(a)). Sterker nog, in deze groepen werd het maximale hypoglykemische effect van insuline waargenomen bij 60 en 90 min, respectievelijk, en was ongeveer van de initiële glykemie waarde. Diabetische dieren behandeld met de lage dosis VOSO4 vertoonden een vergelijkbaar glycemie profiel dan de controle D-groep met een maximale daling bij 60 min, terwijl die behandeld met de hoge dosis een significante () en snelle maximale daling van de glycemie vertoonden bij 30 min na insuline injectie (figuur 2(b)).

In VOSO4 behandelingsgroepen, werd de grootte van pancreaseilandjes waargenomen groter te zijn in vergelijking met hun respectievelijke controle ND en D-groepen (figuren 3 en 4). Statistische analyses toonden aan dat VOSO4 behandelingen een duidelijke toename van het aantal insuline immunopositieve cellen veroorzaakten met ongeveer 20% in ND + 5 en 27% in ND + 10 mg / kg groepen (figuur 5). VOSO4 behandeling verhoogde aanzienlijk het aantal insuline immunopositieve cellen in de STZ-diabetische groepen in een dosis-afhankelijke wijze met 12 en 23%, respectievelijk, met 5 en 10 mg / kg doses (figuur 5). Vergelijking tussen STZ-diabetische behandelde groepen en ND controle ratten gaf geen significante verschillen aan.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 5

Effect van vanadylsulfaat op het aantal bètacellen in %. Waarden zijn gemiddelde ± SD. ; versus ND controle. ; versus D controle. versus D + 5 mg/Kg. Per rat werden 10 eilandjes geanalyseerd.

4. Discussie

We hebben de antidiabetische eigenschappen van vanadium bestudeerd door de effecten ervan op de bloedglucose- en insulinespiegel en op de B-cellen van de endocriene pancreas te onderzoeken.

Gebruik makend van STZ-geïnduceerde diabetische ratten, toonden we aan dat behandeling met vanadylsulfaat (VOSO4) bij 5 en 10 mg/Kg de gemiddelde bloedglucosespiegels significant verminderde op de 10e en 5e dag, respectievelijk, in vergelijking met onbehandelde controlegroep. Op dag 30 vertoonden de diabetische ratten die de hogere dosis van de verbinding kregen een vergelijkbaar glycemieniveau als ND-controledieren. Echter, bij ND ratten, veranderde de behandeling met de lagere dosis VOSO4 de bloedglucosespiegel niet significant, terwijl de hogere dosis een kleine en geleidelijke daling teweegbracht op dag 15 van de behandeling en de glycemie was verminderd met ongeveer 14% op dag 30. Onze resultaten komen overeen met eerdere gegevens die aantonen dat orale toediening van vanadiumverbindingen bij STZ-geïnduceerde of genetisch geërfde of voedingsdiabetische dieren de hyperglykemie aanzienlijk verbetert. Bij mensen rapporteerden Soveid et al. de veiligheid en werkzaamheid van orale vanadylsulfaattherapie gedurende 30 maanden bij type 1 diabetespatiënten door de insulinebehoefte en het bloedglucoseniveau te verlagen.

Uw onderzoek toonde ook aan dat het hypoglykemische effect van VOSO4 gepaard ging met een duidelijke toename van het basale insulinemieniveau in de diabetische groep op een dosisafhankelijke manier. Met een dosis van 10 mg was het insulinemie-niveau van diabetische ratten bijna genormaliseerd. De daling van de bloedglucosespiegel die met name werd geregistreerd bij diabetische ratten die aan vanadiumverbinding werden blootgesteld, kan inderdaad verband houden met de gelijktijdige stijging van de plasma-insulineconcentraties. Deze resultaten waren in overeenstemming met eerdere gegevens betreffende de effectiviteit van vanadiumverbindingen bij het verbeteren van de diabetische toestand.

Verder hebben wij het effect van vanadiumtoediening op de insulinegevoeligheid bij diabetische en niet-diabetische ratten onderzocht. In ND groepen, toonden wij een maximum hypoglycemisch effect van insuline aan 60-90 min na hormoonintroductie. Echter, in D groepen, verbeterde VOSO4 behandeling met een dosis van 10 mg de insuline gevoeligheid met een snellere en meer uitgesproken daling van de bloedglucose na hormoon injectie, terwijl de dosis van 5 mg de glycemie respons van D ratten niet significant veranderde. De verbeterde insulinegevoeligheid geïnduceerd door VOSO4 is in lijn met talrijke studies die aangeven dat vanadium kan worden beschouwd als een krachtige insulinemimetische of insulinetrofe in verschillende weefsels.

Het is aangetoond dat vanadiumverbindingen worden gekenmerkt door meerdere manieren van actie die resulteren in bloedsuikerverlaging. In vivo en in vitro studies meldden dat vanadylsulfaat het glucosetransport en metabolisme in skeletspieren, lever, en vetweefsels verhoogde. Dankzij hun structurele gelijkenis met orthofosfaatanionen, remmen de organische vanadiumderivaten eiwitfosfotyrosinefosfatase . Zij remmen ook de activiteit van PTP-1B, het enzym dat verantwoordelijk is voor de defosforylering van de insulinereceptor, waardoor insulineresistentie ontstaat. Een ander mechanisme voor de verlaging van de bloedglucosespiegel door vanadiumverbindingen is de activering van PKB/Akt-kinase die leidt tot de toename van de glucose-opname door de GLUT4-transporter . De activering van PKB/Akt stimuleert ook de fosforylering van GSK3, wat resulteert in de stimulering van de glycogeensynthese. Aan de andere kant werd ontdekt dat remming van C-jun N-terminal kinase de insulinegevoeligheid verbetert bij experimentele diabetes .

Vanadium verhoogt glucosetransport en -oxidatie en insuline-receptor tyrosine-kinase activiteit en oefent insuline-achtige effecten uit op glucose en lipidemetabolisme door insuline-afhankelijke of insuline-onafhankelijke biochemische paden .

Het is bekend dat STZ-behandeling bètacellen van pancreaseilandjes vernietigt, wat insuline-afhankelijke diabetes mellitus induceert. Dus, in de huidige studie, toonden we een vermindering van het oppervlak van de pancreaseilandjes geassocieerd met een duidelijke daling van het aantal immunoreactieve betacellen voor insuline in de diabetische groep in vergelijking met niet-diabetische controledieren. Echter, in zowel de ND als de D groepen vergrootte de VOSO4 behandeling de grootte van de pancreaseilandjes in vergelijking met de respectievelijke controlegroepen. Het belangrijkste is dat VOSO4 behandeling van diabetische ratten op een dosis-afhankelijke manier het aantal insuline-immunopositieve bètacellen verhoogde, in vergelijking met de diabetische onbehandelde groep, wat suggereert dat VOSO4 de bètacellen kan genereren in STZ-geïnduceerde diabetische ratten. In feite was het aantal bètacellen in eilandjes van diabetische VOSO4-behandelde ratten met 5 en 10 mg niet significant verschillend van die van de ND-groep. Dit is in overeenstemming met eerdere onderzoeken betreffende de pancreatische insulinotrope eigenschap van deze verbinding. Interessant is dat vanadium behandeling ook het aantal beta cellen in eilandjes van niet-diabetische ratten aanzienlijk deed toenemen.

In een muismodel van pancreas alloxan-perfused segment, rapporteerden Waguri et al. processen van beta cellen regeneratie van extra-islet precursor cellen. Inderdaad, in STZ-diabetische ratten, zou VOSO4 behandeling bètacellen proliferatie van intra-islet endocriene cellen en differentiatie van extra-islet voorlopercellen stimuleren.

In conclusie, de huidige studie toont aan dat vanadylsulfaat nuttig zou kunnen zijn als een potentieel antidiabetisch middel. Echter, omdat de huidige bewijzen nog beperkt zijn en vooral gebaseerd op diermodellen en er weinig bekend is over de therapeutische formuleringen en de bijwerkingen van vanadiumverbindingen, is verder onderzoek naar hun gebruik op lange termijn als conventionele therapie voor diabetespatiënten nodig.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgment

Dit werk werd ondersteund door het Tunesische ministerie van Hoger Onderwijs en Wetenschappelijk Onderzoek.