Celdood is cruciaal voor de goede uitvoering van normale en pathofysiologische processen en is alomtegenwoordig in biologische systemen.

Geprogrammeerde vormen van celdood zijn verantwoordelijk voor het produceren van morfologische patronen tijdens de ontwikkeling, negatieve selectie tijdens immuniteit, en de moleculaire ‘wapenwedloop’ die optreedt tussen virale en gastheergenen tijdens infectie, alsmede voor weefselschade die optreedt bij milieustressoren zoals genotoxinen.

Afwijkingen binnen deze celdoodroutes kunnen zich uiten in ziekten, waaronder kanker, degeneratieve aandoeningen en het verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS). Het vermogen van tumorcellen om te ontsnappen aan de geprogrammeerde celdood is een kenmerk van de meeste soorten kanker.

In de afgelopen jaren is duidelijk geworden dat alleen het meten van individuele kenmerken van stervende cellen, zoals kernfragmentatie of membraanpermeabiliteit, niet voldoende is om onderscheid te maken tussen de verschillende celdoodroutes, die apoptose, autofagische celdood en necrose omvatten.

Wat nodig is, is een multi-parameter beoordeling van celdood die de mechanistische gebeurtenissen onthult die “achter de schermen” plaatsvinden. Volgens de aanbevelingen van het Nomenclatuurcomité celdood 2009 kunnen celdoodgerelateerde processen (apoptose, necrose, autofagie) worden ingedeeld naar morfologisch voorkomen, enzymatische criteria, functionele aspecten en immuunkenmerken.

Celdood in diverse vormen

Apoptose

Apoptose verwijst naar een gen-gestuurd celzelfmoordprogramma. Een grote verscheidenheid van cellulaire eiwitten, waaronder receptoren op de celoppervlakte, proteasen en mitochondriale componenten, regelen een delicaat evenwicht tussen celoverleving en dood door apoptose. Mutaties in deze eiwitten kunnen de balans doen doorslaan, wat kan leiden tot ongecontroleerde overleving en proliferatie van tumorcellen. Daarom kan het blootleggen van apoptose-mechanismen leiden tot nieuwe strategieën om deze vorm van celdood voor therapeutische doeleinden te benutten.

Apoptose gaat gepaard met een vermindering van het celvolume, kerncondensatie, DNA-fragmentatie, blebbing van de plasmamembraan en opslorping door fagocyten. Bovendien gaat apoptose gewoonlijk gepaard met mitochondriale membraanpermeabilisatie, gevolgd door activering van de caspasecascade; niet-caspase proteasen kunnen echter ook worden geactiveerd.

Necrose

Necrose werd van oudsher beschouwd als een passieve vorm van celdood. Recente gegevens suggereren echter dat necrose ook een alternatieve vorm van geprogrammeerde celdood kan zijn, waarvan de activering belangrijke gevolgen kan hebben, zoals het induceren van een ontstekingsreactie. Necrose en apoptose zijn morfologisch zeer verschillend. Necrose gaat gepaard met een toename van het celvolume, opzwellen van organellen, scheuren van de plasmamembraan en verlies van intracellulaire inhoud.

Wat het verschil tussen apoptose en necrose betreft, berusten de verschillende methoden om onderscheid te maken tussen apoptotische en necrotische celdood op karakteristieke kenmerken die kunnen worden gevisualiseerd en/of gemeten, zoals celgrootte, celfragmentatie en DNA-splitsing.

Autofagie

Autofagie is een sterk gereguleerd homeostatisch afbraakproces waarbij cellen hun eigen bestanddelen vernietigen via de lysosomale machinerie en recyclen. Dit proces wordt in verband gebracht met diverse ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, veroudering, kanker en de ziekte van Crohn. In sommige gevallen draagt verhoogde autofagie bij tot celdood via uitgebreide kruisbestuiving met pro-apoptotische signaalwegen. Inzicht in de correlatie tussen autofagie en apoptotische celdood is de focus van veel onderzoek, met name in tumorbiologie.

Autofagie vs Apoptose

Autofagische celdood wordt morfologisch gedefinieerd als celdood die optreedt in afwezigheid van chromatinecondensatie maar gepaard gaat met massale vacuolisatie van het cytoplasma. In tegenstelling tot apoptose heeft autofagie weinig of geen associatie met fagocyten. Bij deze vorm van celdood wordt het cytoplasmatisch materiaal in autofagosomen afgezonderd voor afbraak door lysosomen.

Het is thans bekend dat er een wisselwerking bestaat tussen de apoptotische en de autofagie pathways, en studies hebben aangetoond dat BCL2, dat een belangrijke regulator van apoptose is, ook een belangrijke regulator van de autofagie pathway is.

De recente vooruitgang in de chemische biologie, de analyse van de pathways en de verfijnde cytometrie hebben diepere inzichten mogelijk gemaakt in de moleculaire markers en de cellulaire veranderingen die elke celdoodroute kenmerken. Bovendien heeft de evolutie van de technologie het ook mogelijk gemaakt veel van deze beoordelingen uit te voeren als routinematige bench-top experimenten, in lijn met downstream analyses. Samen hebben deze vorderingen de studie van celdood getransformeerd in de ontleding van genuanceerde signaleringsnetwerken die zijn geïntegreerd in complexe systemen.

Een van de centrale kenmerken van celdood die de wetenschappelijke gemeenschap probeert te ontleden is het point of no return langs deze genuanceerde paden. Er zijn zowel omkeerbare als onomkeerbare punten langs elke celdood signaleringsroute en bepalen waar het overgangspunt ligt binnen verschillende contexten is van groot belang vanuit het standpunt van pogingen om in het proces in te grijpen. Ongeacht het type celdood, als de cel eenmaal voorbij het point of no return is, kan de dood niet meer worden voorkomen.

Analyseren van celdood

Om de verschillende vormen van celdood te ontleden, te karakteriseren en te differentiëren zijn twee soorten criteria nodig: beschrijvende (b.v. beeldvorming) en functionele (b.v. inhibitie van pathways). Bijvoorbeeld, DNA-fragmentatie en caspase-activering kunnen elk helpen om apoptose te definiëren, maar deze analyses zijn niet definitief wanneer ze geïsoleerd worden gebruikt, omdat apoptose kan optreden zonder DNA-fragmentatie, en caspase-activering is ook gekoppeld aan andere biologische processen.

Celdood moet daarom altijd worden gemeten met behulp van meerdere methoden, bij voorkeur in hetzelfde monster, waarbij biochemische en morfologische assays zo mogelijk worden gecombineerd. Een reeks technologieën kan waardevolle informatie opleveren over de verschillende celdoodroutes, waaronder beeldvorming, TUNEL, immunologisch gebaseerde assays, flowcytometrie, op beeldvorming gebaseerde cytometrie en technologieën voor adherente celbeeldvorming. Er zijn echter een paar gemeenschappelijke, inherente nadelen met de huidige methoden voor het onderzoeken van celdood die hun nut kunnen beperken.

Zo zijn bijvoorbeeld technologieën als Western Blotting en ELISA niet in staat om per-celspecifieke veranderingen te geven, hoewel zij zeer nuttig zijn voor het verzamelen van informatie over de totale verandering in het proces. Bepaalde beeldvormingsmethoden kunnen beperkingen hebben met betrekking tot de vraag of een gelijkwaardig aantal cellen wordt geteld van monster tot monster, of dat voldoende cellen worden geteld, wat van invloed kan zijn op de reproduceerbaarheid en/of nauwkeurigheid van de resultaten.

Aan de andere kant kunnen methoden zoals multiparametrische flowcytometrie of beeldvormende cytometrie zeer krachtig zijn en inhoudsrijke gegevens opleveren voor analyses van celdood, maar deze methoden kunnen ook beperkingen hebben. De toegang tot instrumentatie kan bijvoorbeeld beperkt zijn, er kan veel deskundigheid en opleiding nodig zijn, en betaalbaarheid kan een uitdaging zijn.

Er is in de industrie behoefte aan eenvoudig te gebruiken, betaalbare, toegankelijke methodologieën die robuust, nauwkeurig en reproduceerbaar antwoord kunnen geven op veel voorkomende, alledaagse vragen die onderzoekers onderzoeken op het gebied van celgezondheid en celdood. Gevestigde en opkomende methoden om effectief onderscheid te maken tussen apoptose, necrose en autofagie worden hieronder beschreven.

Imaging

Celdood is uiteindelijk een morfologisch proces en de gouden standaard voor het analyseren van dit proces is het visualiseren van de cellen. Wanneer celdood in cultuur wordt waargenomen, wordt heel duidelijk wat er gebeurt. Tijdens apoptose bijvoorbeeld, ronden de cellen zich af en lijken ze te koken (“blebbing”). Er zijn verschillende benaderingen beschikbaar om celdood in beeld te brengen, waaronder het eenvoudigweg in real time visualiseren van de cellen in cultuur, het kleuren van cellen met acridine oranje (een essentiële kleurstof die specifiek is voor apoptotische cellen), het histologisch kleuren van gefixeerd weefsel en elektronenmicroscopie. Er zijn ook nieuwe opties beschikbaar in de beeldcytometrie, zoals hieronder verder wordt beschreven.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

De Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)-procedure is een zeer gangbare methode voor het onderzoeken van DNA-fragmentatie die het gevolg is van apoptose. TUNEL labelt de uiteinden van DNA die worden gesplitst in de tussenliggende regio tussen nucleosomen in chromatine, en deze DNA-strengbreuken worden zichtbaar gemaakt met lichtmicroscopie. Hoewel TUNEL een zeer doeltreffende assay voor apoptose is, is een belangrijke beperking van deze aanpak dat TUNEL apoptotische cellen in het laatste stadium van het proces detecteert.

Caspase-activering

Op moleculair niveau is een reeks enzymen, bekend als caspasen, grotendeels verantwoordelijk voor de uitvoering van de apoptotische, maar niet de necrotische, celdoodroute. In antwoord op pro-apoptotische signalen nemen caspasen deel aan een reeks reacties die resulteren in de splitsing van eiwitsubstraten, waardoor de cel uiteenvalt. Caspases bestaan in elke cel van het lichaam als slapende pro-enzymen. Tijdens apoptose vormen caspasen actieve enzymatische tetramermoleculen die hun substraten kunnen activeren of inactiveren.

Deze enzymen herkennen specifiek een vier- of vijf-aminozuursequentie op het doelsubstraat, dat een asparaginezuurresidu omvat als het doel voor splitsing. Caspases spelen een rol bij andere biologische processen, zoals immuniteit; in feite coderen veel virale genomen voor directe remmers van deze caspases. Caspases kunnen worden opgespoord door middel van immunoprecipitatie of immunoblottingtechnieken waarbij caspasespecifieke antilichamen worden gebruikt, of door gebruik te maken van fluorochrome substraten die fluorescerend worden bij splitsing door de caspase. Bovendien kan de betrokkenheid van caspasen worden gevisualiseerd door behandeling van levende culturen met Smac mimeticum, een zeer krachtige inducer van apoptose.

Mitochondriale detectie

Mitochondriën zijn belangrijke regulatoren van celdoodprocessen zoals apoptose. Verlies van de mitochondriale binnenste transmembraanpotentiaal wordt vaak, maar niet altijd, geassocieerd met de vroege stadia van apoptose en wordt verondersteld een rol te spelen in caspase-onafhankelijke celdood. Op fluorescentie gebaseerde assays ontworpen om de functionele status van mitochondriën te evalueren zijn nuttige hulpmiddelen voor het onderzoeken van de rol van mitochondriale activiteit in de apoptosecascade.

Fosfatidylserine en annexine V

Fosfatidylserine (PS), beperkt tot het binnenste membraanblad van levensvatbare cellen, verplaatst zich naar het blootgestelde membraanoppervlak tijdens de vroege stadia van apoptose. Deze gebeurtenis dient als signaal voor fagocyterende cellen om aan te vallen. PS wordt voornamelijk blootgesteld aan de oppervlaktebloedingen van apoptotische cellen. Annexine V heeft een hoge affiniteit voor membranen die het negatief geladen PS bevatten. Deze gebeurtenissen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van flowcytometrie.

Flowcytometrie

Flowcytometrietests voor apoptose zijn nu bijna 25 jaar oud. De vroegste flowcytometrietests voor apoptose analyseerden veranderingen in voorwaartse en zijwaartse verstrooiing en DNA-fragmentatie na behandeling met ethanol. Flowcytometrietests zijn nu gericht op bijna elke fase van apoptose, van de vroegste mitochondriale veranderingen tot caspase-activering, membraanveranderingen en DNA-beschadiging. In tegenstelling tot eerdere tests analyseert flowcytometrie apoptose in afzonderlijke cellen.

Multiparametrische flowcytometrie is een ideale benadering voor het combineren van meerdere celdood assays. FLICA-caspasedetectie, annexine V en een celimpermanente DNA-bindende kleurstof (bv. propidiumjodide) kunnen worden gecombineerd tot een krachtige, meerfasige assay voor apoptose (figuur 1).

Door deze assays te combineren kan de progressie van apoptose worden geanalyseerd, en ontstaat een veel rijker beeld dan een enkele assay alleen kan opleveren.

Een bench-top flowcytometrieplatform kan ook onmiddellijk kwantitatieve cellulaire informatie verschaffen voor tal van analyses van de celgezondheid, celdood, celsignalering, immunologie en celcyclus. Eén zo’n instrument maakt gebruik van de principes van microcapillaire cytometrie, die de analyse van kleine monsters mogelijk maakt. Het platform is gesloten, waarbij de reagentia en software nauw aan elkaar zijn gekoppeld voor specifieke toepassingen, teneinde het proces te vereenvoudigen en de analytische complexiteit voor het uitvoeren en verkrijgen van op cytometrie gebaseerde gegevens te verminderen.

De technologie maakt de analyse van twee markers tegelijk en kan worden gebruikt om tijdsverloop en dosis-respons studies uit te voeren, waardoor dieper inzicht in de mechanismen op het spel, alsmede een meer omvattend beeld van het celdoodproces (figuur 2).

Tot op heden is er slechts één flowcytometrietest beschikbaar om autofagie te analyseren, waarbij de lichtketen 3 (LC3) wordt gemeten. LC3 is een eiwit dat segregeert naar autofagosomen die defuncte mitochondriën en andere intracellulaire organellen fagocytoseren en uiteindelijk naar lysosomen. Autofagie kan worden gedetecteerd door flowcytometrie met behulp van groen fluorescerend eiwit (GFP)-LC3 translocatie (figuur 3).

In deze test wordt een cellijn stabiel getransfecteerd met GFP-LC3. Tijdens de inductie wordt een lysozymremmer toegevoegd om de vernietiging van autofagosomen door lysosomen te blokkeren. Als autofagie optreedt, zal GFP-LC3 zich ophopen in autofagosomen wanneer de remmer aanwezig is en niet worden vrijgegeven in de media. Als autofagie niet optreedt, zal GFP-LC3 zich ophopen in het cytoplasma en vrijkomen in de media. Autofagosoom-geassocieerde GFP-LC3 kan worden gedetecteerd in de intacte cellen door flowcytometry.

Beeldcytometrie

Beeldcytometrie maakt het mogelijk cytometrische gegevens en gecorreleerde cel beelden gelijktijdig worden verzameld, en vele opties bestaan nu voor dit soort analyses. Omdat apoptose zeer variabel en pleiotroop is, kan beeldvorming verifiëren of apoptose optreedt en kan het proces ook tot op zekere hoogte worden gekarakteriseerd door de visualisatie van chromatinecondensatie en cytoskeletale afbraak. Beeldcytometrie biedt ook extra analysemogelijkheden, waaronder pixel-per-pixel-analyse, die nuttig zijn voor apoptotische analyse. Bovendien is trypsine- of Accutase®-onthechting, die apoptotische labels kan “vertroebelen”, niet nodig.

Beeldcytometrie maakt ook de analyse mogelijk van adherente cellen zonder de cellen van hun substraat te verwijderen. Om deze reden maken veel laboratoria gebruik van beeldcytometrie voor de analyse van adherente apoptotische cellen. Adherente cellen die van hun substraat worden gerukt, hetzij door schrapen of door trypsine, kunnen het apoptotische fenotype verstoren, of zelfs het apoptotische proces zelf induceren. Beeldcytometrie maakt het mogelijk adherente cellen gedurende de analyse adherent te houden door cellen direct op het kamerglaasje te kleuren. Het is belangrijk op te merken dat adherente cellen zich zullen afronden zodra zij apoptose ondergaan, zodat sommige cellen die zich in de latere stadia van apoptose bevinden, verloren kunnen gaan.

Een stroom-gebaseerd beeldcytometriesysteem biedt ook directe correlatie tussen cytometrie en beeldvorming, en combineert daardoor cytometrische en morfologische analyse. In een beeldvormingssysteem op basis van stromen worden de cellen niet op een objectglaasje in beeld gebracht, maar rechtstreeks in de stroom. Wanneer cytometrie en beeldvorming worden gecorreleerd, kunnen levensvatbare, vroegtijdige, tussentijdse en laattijdige apoptotische cellen worden geselecteerd en geanalyseerd (figuur 4).

Conclusie – celdood: Onderscheid maken tussen apoptose, necrose & autofagie

Celdood is een natuurlijk proces dat essentieel is voor vele normale fysiologische functies voor zowel ontwikkeling als homeostase. Bovendien worden veranderingen in celdood-signaleringsroutes in verband gebracht met verschillende ziekten. De meting van individuele kenmerken van stervende cellen is niet voldoende om onderscheid te maken tussen de verschillende celdoodroutes, die apoptose, necrose en autofagie omvatten; in plaats daarvan is een multi-parameter beoordeling nodig die zowel beschrijvende als functionele criteria omvat.

De recente technologische vooruitgang maakt thans een dieper inzicht mogelijk in de moleculaire markers en cellulaire veranderingen die kenmerkend zijn voor elke celdoodroute, en heeft het ook mogelijk gemaakt veel van deze analyses uit te voeren als routinematige benchtop-experimenten. DDW

–

Dit artikel stond oorspronkelijk in het DDW Winternummer 2014

–

Dr. John Abrams is hoogleraar celbiologie; zijn onderzoek bestudeert de in vivo moleculaire netwerken die betrokken zijn bij celdoodregulatie en verkent determinanten van chromatineorganisatie. Hij trad in 1994 in dienst bij het University of Texas Southwestern Medical Center en werd in 2004 programmaleider van het graduate programma genetica en ontwikkeling. Dr. Abrams promoveerde aan de Universiteit van Stanford.

Dr William G. Telford werd in 1999 stafwetenschapper bij het National Cancer Institute in de National Institutes of Health, en is directeur van het flowcytometrie-kernlaboratorium in de NCI Experimental Transplantation and Immunology Branch. Hij is gepromoveerd in de microbiologie aan de Michigan State University en heeft een postdoctorale opleiding in de immunologie gevolgd aan de University of Michigan Medical School.

Louise Rollins is productmanager bij EMD Millipore Corporation waar zij de ontwikkeling ondersteunt van de Muse® Cell Analyzer, een geminiaturiseerde flowcytometer en zijn toepassingsspecifieke assaykits en softwaremodules voor de routineanalyse van celgezondheid en celdood.