Eigenschappen en detectie van Botulinum neurotoxine
De clostridia produceren meer soorten eiwittoxinen dan enig ander geslacht van micro-organismen. De opmerkelijke eigenschap van Clostridium botulinum is zijn vermogen om een neurotoxine met buitengewone potentie te synthetiseren. BoNT’s vormen een familie van farmacologisch vergelijkbare toxinen die zich binden aan perifere cholinerge synapsen en de exocytose van acetylcholine bij de neuromusculaire juncties blokkeren. BoNT’s worden in levensmiddelen, in de darm en in kweek geproduceerd als progenitor-toxinecomplexen die bestaan uit botuline-neurotoxine geassocieerd met niet-toxische eiwitten. Van de niet-toxische componenten van de complexen is aangetoond dat zij stabiliteit verlenen aan het neurotoxine en inactivering door spijsverteringsenzymen in de darm voorkomen.
De diagnose van botulisme wordt in het algemeen gesteld door beoordeling van klinische symptomen bij patiënten, en bij door voedsel overgedragen uitbraken, door clustering van gevallen bij een groep mensen die een gemeenschappelijk voedingsmiddel hebben gegeten. Bij de meeste onderzoeken naar botulisme wordt in de eerste plaats gestreefd naar de opsporing van de aanwezigheid van BoNT, aangezien sporen van C. botulinum wijdverspreid zijn in het milieu en veel levensmiddelen besmetten. De opsporing van BoNT in het bloed, de maaginhoud en het voedsel vormt de bevestiging van botulisme. Isolatie van C. botulinum uit een verdacht voedingsmiddel, uit de ontlasting van zuigelingen met botulismesymptomen of uit wonden levert ondersteunend bewijs voor de diagnose van botulisme. Het geeft echter in de meeste gevallen geen bevestiging, aangezien sporen worden aangetroffen in voedingsmiddelen en incidenteel in de feces van gezonde volwassenen.
BoNT wordt bij voorkeur opgespoord met behulp van een bioassay van het toxine dat uit een voedingsmiddel of klinisch monster is geëxtraheerd. Het extract wordt intraperitoneaal bij muizen ingespoten en de dieren worden gedurende maximaal vier dagen periodiek geobserveerd op typische tekenen van botulisme. Afhankelijk van de aanwezige hoeveelheid BoNT worden de symptomen van botulisme over het algemeen binnen 4-24 uur waargenomen. Karakteristieke symptomen zijn een verminderde mobiliteit van de dieren, het schudden van de vacht, ademhalingsmoeilijkheden, samentrekking van de buikspieren waardoor een wespmorfologie ontstaat, gevolgd door stuiptrekkingen en de dood. Dieren die deze verschijnselen vertonen sterven gewoonlijk binnen 24-48 uur. Dieren die eerder dan 2 uur of na 48 uur sterven, moeten worden geacht te zijn bezweken aan andere stoffen dan BoNT. De dood als gevolg van BoNT wordt bevestigd door neutralisatie met serotype-specifieke antitoxines.
Complicaties worden vaak aangetroffen in de bioassay in muizen van BoNT afkomstig van klinische specimens en van bepaalde voedingsmiddelen. Met name sterfgevallen veroorzaakt door niet-botulinum interfererende stoffen komen vaak voor. Deze niet-specifieke sterfgevallen kunnen over het algemeen worden vermeden door de interfererende dodelijke stof te verdunnen tot een eindpunt waar de dood wordt veroorzaakt door de meer potente BoNT. Soms kan in een monster dat wordt geanalyseerd meer dan één serotype BoNT aanwezig zijn, en voor bevestiging daarvan zou neutralisatie door een mengsel van antitoxinen nodig zijn. Bij voedingsmiddelen of klinische monsters kunnen niet-botulinumsterfteverschijnselen optreden door infectie of door de aanwezigheid van endotoxinen. Infectieuze agentia kunnen worden verwijderd door membraanfiltratie of door toevoeging van antibiotica aan het te testen extract. Extracten die endotoxines bevatten, kunnen in het algemeen tot een geschikt eindpunt worden verdund, of de endotoxines kunnen door adsorptie worden verwijderd. Bij extracten van niet-proteolytische stammen van C. botulinum (groep II) wordt de toxiciteit verhoogd door activering met een protease zoals trypsine. In sommige levensmiddelen kan trypsine toxische peptiden genereren en daarom moet de reactie na 30-60 minuten worden beëindigd door toevoeging van trypsineremmer van soja.
Botulinum kan uit levensmiddelen worden geïsoleerd door verrijking in een geschikt groeimedium, zoals gekookt vlees-glucosebouillon of media met peptonen, gistextract en glucose. C. botulinum heeft complexe behoeften aan voedingsstoffen en vereist een rijk medium voor groei. Voor de isolatie is het vaak nuttig een deel van het voedsel of het klinische monster te verhitten tot 80° of 60°C om te selecteren op sporen van respectievelijk groep I en II C. botulinum. Soms wordt 50% ethanol gebruikt om vegetatieve cellen te inactiveren in voedselmonsters die op C. botulinum van groep II worden onderzocht. Na aanrijking wordt de aanwezigheid van BoNT bepaald met behulp van een bioassay in muizen, zoals eerder beschreven. Selectieve isolatie-agars met antibiotica, waaronder cycloserine, sulfamethoxazol en trimethoprim, zijn gebruikt voor de isolatie van groep I C. botulinum uit klinische monsters.
Er zijn verschillende immunologische methoden ontwikkeld voor de detectie van BoNT, maar de meeste zijn niet zo gevoelig als de bioassay in muizen en zij hebben ook het potentiële nadeel dat zij biologisch inactief BoNT detecteren. Verscheidene vorderingen in enzyme-gekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn gemaakt om deze nadelen te verlichten en het is waarschijnlijk dat ELISA zal worden gebruikt om de bioassay in muizen aan te vullen maar niet te vervangen.