Abstract
Deze studie onderzoekt het mechanisme dat ten grondslag ligt aan het verbeterende effect van zink op de vruchtbaarheid bij obese ratten aan de hand van proteomics. De effecten van drie verschillende dosissen ZnSO4 op de spermatogenese en de hormoonspiegels werden bestudeerd. Testiculaire spermatogenese werd geobserveerd door middel van HE-kleuring. Serum oestrogeen- en testosteronniveaus werden gemeten met chemiluminescente micropartikel immunoassay. Proteomische analyse van het sperma werd uitgevoerd met vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. De DAVID database werd gebruikt om de GO verrijkingsanalyse en de KEGG pathway analyse van de differentieel tot expressie komende genen uit te voeren, en de STRING online database werd gebruikt om een PPI netwerk te construeren. Het aantal zaadcellen, de beweeglijkheid van de zaadcellen en de testosteronhormonen van de met ZnSO4 behandelde rattengroep waren verhoogd. ZnSO4 verbeterde de testiculaire structuur en de spermatogenese-afwijkingen veroorzaakt door obesitas. Proteomische analyse toonde aan dat er 401 differentieel tot expressie komende eiwitten waren in een totaal van 6 spermamonsters van de met ZnSO4 behandelde groep en de obesitas groepen. De differentieel tot expressie komende eiwitten werden ingevoerd in de DAVID website. De 341 geïdentificeerde eiwitten werden vervolgens geclassificeerd op basis van hun biologische functies. De KEGG-analyse toonde aan dat de verrijkte signaalroutes glycolyse/gluconeogenese, koolstofmetabolisme, citraatcyclus, vetzuurmetabolisme, en pyruvaatmetabolisme omvatten. Sommige eiwitten bleken geassocieerd te zijn met valine-, leucine- en isoleucine-afbraaktrajecten. STRING analyse leverde 36 knooppunt-eiwitten op. Cytoscape analyse toonde aan dat deze eiwitten voornamelijk deelnamen aan negen netwerken, waaronder metabole processen, oxidatie-reductie, aërobe ademhaling, RNA splicing, en glutathion conjugatie. ZnSO4 kan de vruchtbaarheid van zwaarlijvige mannelijke ratten verbeteren door de regulering van eiwitexpressie gerelateerd aan metabolisme, ontsteking, en sperma rijping.
1. Inleiding
Obesitas wordt geassocieerd met mannelijke onvruchtbaarheid. Er is een zekere samenhang in de tijd tussen de toename van mannelijke onvruchtbaarheid, de afname van de semenkwaliteit en de toename van obesitas. Zwaarlijvigheid leidt tot pathologische veranderingen in de testiculaire ultrastructuur, en de apoptose van spermatogene cellen is aanzienlijk toegenomen. De afname van het aantal rijpe zaadcellen kan een van de redenen zijn die leiden tot het lage spermatogene vermogen van zwaarlijvige mensen.
Er zijn stoornissen in het sporenelementmetabolisme bij zwaarlijvige mensen. De verstoring van het sporenelementenmetabolisme in het lichaam zal overeenkomstige effecten op het vetmetabolisme veroorzaken. In het mannelijk voortplantingssysteem worden zinkionen hoofdzakelijk gedistribueerd in de testis, de bijbal, de prostaat en het sperma. Zink is een marker van de prostaatfunctie. Bovendien reguleert het de spermafunctie, fungeert het als cofactor voor de meeste enzymreacties en helpt het de beweeglijkheid van sperma te handhaven. Zink speelt ook een belangrijke rol bij de ontwikkeling van de testikels en de vorming van sperma. Een tekort aan zink verhoogt de apoptose van kiemcellen in de testis van muizen aanzienlijk en veroorzaakt een stilstand van de spermatogenese en schade aan de bevruchting. Studies hebben aangetoond dat zwaarlijvige mannen 3,5 keer meer kans hebben op oligozoospermie dan mannen met een normaal gewicht . Zinksupplementatie kan het gewicht van zwaarlijvige mensen verminderen. De bloedglucosestatus (nuchtere bloedglucose), bloedlipidenparameters (totaal cholesterol, triglyceridengehalte, hoge-densiteit-lipoproteïnecholesterol en lage-densiteit-lipoproteïnecholesterol) en bloeddruk worden verbeterd na zinksupplementatie . Oraal zinkpreparaat kan het zinkgehalte in zaadplasma verbeteren, de transformatie van sperma kerneiwit bevorderen (d.w.z. van lysine naar arginine), en de voortijdige depolymerisatie van de sperma kern remmen. Het kan de beweeglijkheid van het sperma en de kwaliteit van het sperma van onvruchtbare patiënten verbeteren zonder duidelijke bijwerkingen. De toepassing van proteomics in het begrijpen van de effecten van ZnSO4 behandeling op sperma-eiwitten bij obesitas is echter nog beperkt en verder onderzoek is vereist.
In deze studie werden de effecten van drie verschillende doses ZnSO4 op spermatogenese en hormonale niveaus van obese ratten onderzocht. Het mechanisme dat aan dit effect ten grondslag ligt werd verder geanalyseerd door proteomische analyse.
2. Materialen en Methoden
2.1. Dieren
De 7 weken oude Sprague Dawley ratten (met een gewicht van 180-200 g) werden gekocht van het Experimental Animal Center van de Hebei Medical University. Ze werden gehouden op een 12 h donker / licht-cyclus in een lucht-gecontroleerde ruimte (temperatuur, ; luchtvochtigheid, ) met vrije toegang tot water en dierlijk voedsel. Alle dierexperimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Hebei Instituut voor Gezinsplanning Wetenschap en Technologie.
2.2. De ratten werden willekeurig verdeeld in twee groepen: normaal voer groep (15 dieren per groep) en obesitas model groep (30 dieren per groep). Elke groep werd gedurende 8 weken gevoed met het corresponderende dieet, d.w.z. een normaal chow dieet voor de normale groep en een vetrijk dieet voor de obesitas-modelgroep. Het lichaamsgewicht van de ratten werd wekelijks gewogen en gedurende 8 weken genoteerd. Het obesitas-model werd als succesvol beschouwd wanneer het gemiddelde lichaamsgewicht van de modelgroep 1,2 maal zo hoog was als dat van de controlegroep. De lengte van de ratten werd gemeten (neuspunt tot anus), en de Lee-index werd berekend met de formule
Na het opzetten van het obesitas-model, werden de modelratten willekeurig verdeeld in twee groepen: de obesitas-groep en de met ZnSO4 behandelde groep. De ratten in de met ZnSO4 behandelde groep kregen gedurende 4 weken ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) via orale toediening. Aan het einde van het experiment werden het lichaamsgewicht, het testiculair gewicht, het epididymaal gewicht en het peritesticulair vet van elke groep gemeten, en werd er bloed afgenomen uit de abdominale aorta. Sperma monsters werden geoogst van de caudale bijbal. De testikels werden verwijderd.
2.3. De linker epididymis van elke rat werd onmiddellijk na het slachten geoogst en overgebracht in een buisje met 1 ml warme (37°C) zoutoplossing. Ze werden vervolgens geschud bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de verspreiding van spermatozoa mogelijk te maken. Ongeveer 10 ul van verdunde spermasuspensie werd overgebracht naar elke telkamer van de hemocytometer om de spermaconcentratie en motiliteit te bepalen. De beweeglijkheid werd gemeten als het percentage beweeglijke spermatozoa (a+b graad) onder het totaal aantal spermatozoa.
2.4. Bepaling van nuchtere serumglucose, bloedlipiden en insuline
Totale cholesterolen, triglyceriden, lipoproteïnen met lage dichtheid en lipoproteïnen met hoge dichtheid in serum werden gemeten op een Siemens Centaur XP-analysator met een chemiluminescente microdeeltjes immunoassaykit (Medical System Biotechnology Co., LTD). De nuchtere serumglucose werd gemeten met een glucosedetectiekit (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China) op een ACCUTE TBA-40FR analyzer (Toshiba Medical Systems Co., Tokyo, Japan). Serumspiegels van insuline werden bepaald door chemiluminescentie immunoassay op een UniCel DxI 800 systeem (Beckman Coulter, CA, USA) met overeenkomstige reagentia (Beckman Coulter, CA, USA).
2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Leptine niveau werd bepaald door ELISA kits (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, China). Na beëindiging van de reactie werd de absorptie afgelezen bij 450 nm.
2.6. HE Staining
De testes werden ’s nachts in Bouin’s oplossing gefixeerd. De testes werden vervolgens gedehydrateerd met alcohol en ingebed in paraffine. De monsters werden op 5 μm dikte doorgesneden en gekleurd met HE-kleuring. Testiculaire spermatogenese werd waargenomen onder een lichtmicroscoop.
2.7. Meting van Androgeen Hormonen
Serum oestrogeen en testosteron niveaus werden gemeten op een Siemens Centaur XP analyzer door chemiluminescent microparticle immunoassay. De detectiekit werd aangekocht bij Siemens Healthcare Diagnostic Inc. en Cayman Chemical, Michigan, USA.
2.8. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie
De sperma-eiwitmonsters die in deze studie werden gebruikt, waren afkomstig van de drie groepen (normale groep, obesitas-modelgroep, en ZnSO4-behandelde groep). Spermamonsters werden geoogst uit de caudale epididymis. De eiwitten werden kort geëxtraheerd met een lysaatbuffer met 8 M ureum, 10 mM DTT en een proteaseremmer. Sonificatie werd uitgevoerd gedurende 3-5 min. Het supernatant werd verzameld na 20000 g centrifugatie gedurende 10 min bij 4°C, en de eiwitten werden gekwantificeerd met de Bradford-methode. De geëxtraheerde eiwitten werden geïncubeerd met 100 mM TEAB tot 100 μl en vervolgens met 200 mM TCEP bij 55°C gedurende 1 uur. Daarna werd 5 μl 375 mM iodoacetamide (IAA) toegevoegd. Na incubatie in het donker gedurende 30 min werd voorgekoelde aceton toegevoegd en werd gedurende een nacht bij -20°C geïncubeerd. Het supernatant werd zorgvuldig verwijderd na 8000 g centrifugeren bij 10 ° C gedurende 10 min, en het lysaat werd bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min te drogen. Tenslotte werden 100 μg eiwit, 100 μl 100 mM TEAB-oplossing, en trypsine enzym verhouding eiwit (1 : 50) gemengd en de enzym digestie werd uitgevoerd ’s nachts bij 37 ° C.
Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie: gedeeltelijk verteerde monsters werden genomen en opgelost in oplossing A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA). Na centrifugatie bij 20000 g gedurende 30 minuten, werd het supernatant genomen en de eiwitsequentie werd gedetecteerd door EASY-nLC liquid phase-Q Exactive massaspectrometer (Amerikaanse Thermo Fisher).
Massaspectrometrie voorwaarden waren 90 min voor data-acquisitie tijd, 2 kV voor sproeispanning, 320 ° C voor capillaire temperatuur, 27% voor genormaliseerde botsing energie, en 300-1400 Da voor collectie massabereik. Primaire parameters waren 70000 voor resolutie, 36 voor AGC-doel, 60 ms voor maximale IT, en profiel voor spectrumgegevenstype. Secundaire parameters waren 17500 voor resolutie, 54 voor AGC-doel, 80 ms voor maximale IT, en 3,0 m/z voor isolatievenster.
2.9. Data Retrieval
In de MaxQuant 1.5.2.8 zoekmachine is de eerste fout 20 ppm, de tweede fout is 0.02 Da. De vaste wijziging is als volgt. Cysteïne is gemodificeerd tot Carbamidomethyl-Cys, en de variabele modificatie is als volgt: Oxidatie-M, LysisC of Trypsine, of Glu-C ontsluiting. Enzymatische digestie staat tot 2 ontbrekende plaatsen toe. Data gap filling, normalisatie, en verschil screening () werden allemaal uitgevoerd met behulp van de Perseus software standaardinstellingen. In totaal werden 1344 eiwitten geïdentificeerd en gekwantificeerd in 6 monsters van beide groepen. Kwalitatieve en kwantitatieve informatie van Zn en G groep op differentiële eiwitten werden verkregen. Perseus software voerde -test en significantie analyse uit op de kwantitatieve resultaten en verhoudingen van eiwitten. De verkregen differentiële proteïnelijst is als volgt: een totaal van 401 significante differentiële proteïnen werden verkregen door -test resultaten en differentiële distributie analyse resultaten.
2.10. GO (Gene Ontology) en KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Analysis
Differentiële proteïne werd geïmporteerd in de DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) website (https://david.ncifcrf.gov/) voor basis bioinformatica extractie. De webtools van DAVID werden gebruikt om te zoeken naar functionele annotatietermen en paden die verrijkt waren in de hierboven geïdentificeerde eiwitten, met inbegrip van cellulaire component, moleculaire functie en biologisch proces.
2.11. Eiwit Interactie Netwerk Analyse
De gescreende differentiële eiwitten werden geïmporteerd in STRING (https://string-db.org/) online database voor analyse. De differentiële gen-interactie netwerkkaart werd getekend. De interactieve netwerkgegevens werden geëxporteerd naar de Cytoscape 3.2 software om het netwerkcentrum knooppunt proteïne te bepalen.
2.12. Statistische analyse
De gegevens werden weergegeven als . De statistische analyse werd uitgevoerd in SPSS22.0 met behulp van een-weg-analyse van variantie (ANOVA) met een waarde < 0,05 beschouwd als statistisch significant.
3. Resultaten
3.1. Sperma Parameters en Testosteron Hormoon Niveau Veranderingen in Sperma na ZnSO4 Behandeling
Vergeleken met de controlegroep, namen het lichaamsgewicht, peritesticulair vet, Lee’s index, totaal cholesterol, triglyceride, hoge dichtheid lipoproteïne, en leptine van obesitas groep ratten en leptine van ZnSO4-behandelde groep ratten significant toe. Vergeleken met de controlegroep nam de lagedichtheid-lipoproteïne van obesitasgroepsratten significant af. Vergeleken met de obesitasgroep daalden het lichaamsgewicht, het peritesticulaire vet en de Lee’s index in de met ZnSO4 behandelde groep, en het verschil was statistisch significant (tabel 1). Om de effecten van ZnSO4 op de vruchtbaarheid van ratten vast te stellen, werd elke groep spermaparameters eerst geëvalueerd volgens de WHO-criteria van 2010. Het aantal zaadcellen en de beweeglijkheid van de zaadcellen waren geremd in de obesitasgroep, zoals blijkt uit Tabel 2. Vergeleken met de obesitasgroep namen het aantal zaadcellen en de beweeglijkheid van de zaadcellen van de met ZnSO4 behandelde ratten toe, wat suggereert dat ZnSO4 de spermaparameters bij obese ratten verbetert. Obesitas zelf kan een toename van bloedlipiden veroorzaken, maar onze resultaten toonden aan dat bloedglucose, bloedlipiden, en insuline niveaus niet het niveau van diabetes bereikten. Men kan ervan uitgaan dat de verstorende factoren van diabetische complicaties waren uitgesloten. Verder hebben we het serum testosteron niveau bepaald. De resultaten toonden aan dat de testosteron hormonen toenamen in de met ZnSO4 behandelde groep vergeleken met de obesitas groep (Tabel 2). Dus, ZnSO4 behandeling kon de spermakwaliteit van obese ratten verbeteren.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Noot: # vergeleken met normale controle; vergeleken met obesitas.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Note: vergeleken met normale controle; vergeleken met obesitas.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. ZnSO4 behandeling verbetert het herstel van testiculaire beschadiging veroorzaakt door obesitas
Vervolgens voerden we histologie analyse van testiculaire weefsel en de resultaten werden getoond in figuur 1. Volgens testis histologie, de normale groep toonde normale spermatogenese (figuren 1 (a) en 1 (d)), terwijl de obesitas groep vertoonde verstoorde spermatogenese als het lumen van de zaadlobben was bijna leeg (figuren 1 (b) en 1 (e)). Zoals verwacht, vertoonde de met ZnSO4 behandelde groep een aanzienlijke verbetering van de testis histologie in vergelijking met de obesitas groep met het verschijnen van normale Sertoli en Leydig cellen en ongestoorde spermatogenese (Figuren 1(c) en 1(f)). Dus, ZnSO4 kan verbeteren testiculaire structuur en spermatogenese afwijkingen veroorzaakt door obesitas.
3.3. Classificatie van 341 sperma-eiwitten door Bioinformatica: Cellular Component, Molecular Function, and Biological Process
Om de differentieel tot expressie komende proteïnen te bepalen, werd proteomische analyse uitgevoerd. Een totaal van 1344 eiwitten werden geïdentificeerd en gekwantificeerd in een totaal van 6 spermamonsters van de met ZnSO4 behandelde groep en de obesitas groep. Perseus software voerde -test en differentiële significantie analyse uit op de kwantitatieve resultaten en verhoudingen van eiwitten. In totaal werden 401 significante eiwitten verkregen. Differentiële eiwitten werden ingevoerd in de DAVID website voor de ZnSO4-behandelde groep en de obesitas groep verschillen in eiwit functie. In GO classificatie werden 371 eiwitten geanalyseerd, en 30 eiwitten kwamen niet overeen. De 341 geïdentificeerde eiwitten werden vervolgens geclassificeerd op basis van hun biologische functies. We gebruikten de webtools van DAVID om te zoeken naar functionele annotatietermen en paden die verrijkt waren in de hierboven geïdentificeerde eiwitten. De resultaten van deze analyses zijn weergegeven in figuur 2. We richtten ons op de ontologie van cellulaire component, moleculaire functie, en biologisch proces voor functionele annotatie term verrijking analyse met en .
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
In de “cellulaire component” groep (figuur 2(a)), toonde de categorie-analyse aan dat 59% van de eiwitten met significante verschillen organelcomponenten waren, en 60,7% van deze waren organelbestanddelen. Bovendien behoorde 29,6% van de eiwitten tot een macromoleculair complex. Uit de “moleculaire functie” GO term analyse bleek dat 22% van de eiwitten werden geclassificeerd als eiwitten met katalytische activiteit (figuur 2(b)). De andere eiwitten konden worden geclassificeerd als eiwitbindend, rRNA-bindend, en enzymbindend. Wat de databank “biologische processen” betreft (figuur 2(c)), werd de meerderheid van de 24% eiwitten in verband gebracht met metabolische processen. Bovendien werden eiwitten in verband gebracht met transport, signaaltransductie, celdood, celadhesie, immuunsysteemproces, en voortplanting. De resultaten van de signaalroute-analyse (figuur 2(d)) met geconcentreerde eiwitten en verrijking zijn als volgt. Meerdere metabolische routes zoals glycolyse/gluconeogenese, koolstofmetabolisme, citraatcyclus (TCA-cyclus), vetzuurmetabolisme en pyruvaatmetabolisme zijn verstoord en beïnvloed, en van sommige eiwitten is aangetoond dat ze geassocieerd zijn met valine-, leucine- en isoleucine-afbraakroutes.
3.4. Zink Effecten worden verder geïdentificeerd door Differentially Expressed Sperm Proteins
Kwantificatie analyse werd uitgevoerd om eiwitniveaus tussen de drie groepen te vergelijken. In de differentiële eiwitten selecteerden we metabole, zinktransport-geassocieerde eiwitten en knooppunt-eiwitten in het netwerk (Tabel 3). Eiwitten met statistisch significante veranderingen werden getoond in Figuur 3. Deze eiwitten waren ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR, en TM165. Vergeleken met de obesitas groep, was de expressie van ARG2, COX5B, en ZNT1 in de met ZnSO4 behandelde groep significant verlaagd, terwijl de expressie van LYAR en TM165 significant verhoogd was.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.5. Het Differentiële Eiwit Interactie Netwerk wordt vastgesteld met behulp van de STRING Network Database
STRING is een online analyse software die de interactie tussen bekende eiwitten analyseert en voorspelt. STRING software stelt een scoringsmechanisme in om overeenkomstige gewichten te maken op verschillende gegevensbronnen en geeft uiteindelijk een uitgebreide score en construeert dan een netwerkkaart van eiwit-eiwit interacties. De 341 gescreende differentiële proteïnen werden geïmporteerd in de online database STRING (http://string-db.org/) voor analyse, en 341 proteïnen werden geïdentificeerd, en de differentiële gen-interactie netwerkkaart werd gegenereerd. Daarna werden de interactieve netwerkgegevens geëxporteerd naar de Cytoscape 3.2 software om het netwerk center node eiwit te bepalen. Men kan zien dat het netwerk van differentiële eiwitsamenstelling complex is (Figuur 4). Vervolgens gebruikten we de Cytoscape plugin om de knooppunt-eiwitten in het netwerk te analyseren, en een totaal van 36 knooppunt-eiwitten werden verkregen uit de analyse (tabel 3). Uit een lijst van topnetwerken, gegenereerd met behulp van STRING, selecteerden we de subnetwerken. Cytoscape analyse toonde aan dat deze eiwitten voornamelijk deelnamen aan negen netwerken waaronder metabolisch proces, oxidatie-reductie, aerobe ademhaling, RNA splicing, en glutathion conjugatie.
4. Discussie
De WHO definieert een persoon met abnormale of overmatige vetophoping als overgewicht of obesitas, en deze toestand vormt een groeiende bedreiging voor de gezondheid van mensen wereldwijd . Uit sommige rapporten blijkt dat het percentage zwaarlijvigen snel toeneemt, waardoor niet alleen het risico op ziekten toeneemt, maar ook het risico van patiënten op het ontwikkelen van voortplantingsstoornissen. Naarmate de voortplantingsfunctie van mannen wereldwijd verslechtert, hebben steeds meer mensen zich gerealiseerd dat zwaarlijvigheid de kwaliteit van het sperma vermindert. Met een verhoogde BMI worden de spermaparameters veranderd, waardoor de fysieke en moleculaire structuur van spermatozoa verandert. Eerdere studies hebben aangetoond dat de spermaconcentratie en het totaal aantal beweeglijke zaadcellen nadelig beïnvloed werden door een hoge BMI . In de huidige studie vertoonden ratten in de obesitasgroepen een significante afname van de spermaconcentratie en de beweeglijkheid van sperma vergeleken met die in de groep met een normaal gewicht, terwijl ZnSO4 de spermaparameters wel verbeterde in vergelijking met de obesitasgroep.
Evenwichtigheden in geslachtshormonen kunnen van invloed zijn op de mannelijke voortplanting, en een overgewichtsstatus kan van invloed zijn op de hormoonspiegels bij mannen . Tegelijkertijd hebben studies aangetoond dat obesitas nauw samenhangt met endocriene stoornissen, zoals geslachtshormoonafwijkingen . Zwaarlijvigheid bij mannen heeft een negatieve invloed op het mannelijke voortplantingspotentieel als gevolg van veranderingen in de hormoonspiegels . Daarom testten we de serumspiegels in elke groep. Testosteron hormonen stegen in de met ZnSO4 behandelde groep vergeleken met de normale en obesitas groepen. Het blijkt dat de ZnSO4-behandeling de androgeen hormoonspiegels aanzienlijk verhoogde om het niveau van de normale controlegroep te evenaren. Vermindering van het lichaamsgewicht en het vetgehalte in het bloed bij met ZnSO4 behandelde ratten kan de Leydig-cellen herstellen, waardoor het testosterongehalte toeneemt. Als gevolg hiervan kan een functioneel mannelijk voortplantingssysteem worden geregenereerd, dat de spermatogenese en de regeneratie van de testikelstructuur bevordert. Het is duidelijk dat de testis histologie van de ZnSO4-behandelde groep is verbeterd met Sertoli en Leydig cellen geregenereerd en het sperma in het lumen hersteld. Daarom biedt een grootschalige vergelijkende proteomics een effectieve aanpak om eventuele eiwitexpressie verschillen tussen de obesitas en ZnSO4-behandelde groepen te identificeren. Onze studie identificeerde de verschillen in eiwitexpressie profielen tussen normaal vruchtbaar sperma en sperma van ZnSO4-behandelde groepen.
GO annotatie analyse toonde aan dat de 24% eiwitten geassocieerd waren met metabool proces en 22% van de eiwitten werden geclassificeerd als eiwitten met katalytische activiteit. De andere eiwitten werden geclassificeerd als eiwitbindend, rRNA-bindend, en enzymbindend, inclusief ATP-binding. Het is bekend dat ATP-bindende proteïnen een fundamentele rol spelen in biologische processen, wat wijst op veranderingen in synthetische en metabole processen. Mitochondriën zijn organellen die energie (ATP) leveren aan cellen. Mitochondriën zijn ook het voornaamste doelwit van oxidatieve stress. In het mannelijk lichaam zijn mitochondriën de belangrijkste energiecentrales in het proces van de rijping van spermatogene cellen en leveren zij ook energie voor de spermatozoa na de ejaculatie. Wanneer oxidatieve stress optreedt bij zwaarlijvige mannen, kunnen de mitochondriën in sperma dus ernstig beschadigd raken. Sperma is gevoelig voor oxidatieve stress en heeft niet het vermogen om schade te herstellen. Vetrijke voeding induceert oxidatieve stress bij zwaarlijvige ratten, waardoor schade aan de mitochondriale membraan van het sperma ontstaat en de mitochondriale functie wordt aangetast. Egwurugwu et al. concludeerden dat zinksulfaat bij fysiologische doses een aantal significante positieve effecten had op androgeen en spermakwaliteit. Het was echter schadelijk bij hogere doses.
ARG2 is bekend te lokaliseren in mitochondriën . Het speelt ook een cruciale rol in de productie van ornithine, een precursor van proline, hydroxyproline en polyamine, en is essentieel voor de celproliferatie. Obesitas en de daarmee gepaard gaande ziekten worden gekenmerkt door lage niveaus van chronische ontsteking . ARG2 bevordert pro-inflammatoire reacties in macrofagen en draagt bij tot het bewijs van atherosclerose en aan obesitas gerelateerde insulineresistentie . Wij denken dat vroege obesitas kan leiden tot een upregulatie van arginase, resulterend in systemische veranderingen in arginase en arginine metabolieten. Upregulatie van ARG2 in de zwaarlijvige groep kan geassocieerd worden met celproliferatie en chronische ontsteking veroorzaakt door zwaarlijvigheid. Arginase verbetert obesitas-geïnduceerde leverlipide en systemische vetafwijkingen door remming van activering van pathways betrokken bij lever triglyceride metabolisme en mitochondriale functie.
Van deze eiwitten is COX5B in het bijzonder van groot belang en gekoppeld aan mitochondriale functie en cellulaire energieproductie. Cytochroomoxidase (COX, Complex IV) is een enzym van de mitochondriale elektronentransportketen dat zich in het mitochondriale binnenmembraan bevindt, en waarvan de activiteit nodig is om de protonmotorische kracht op te wekken die de ATP-synthese verderop in de keten aandrijft. Het is een van de drie mitochondriale isovormen van cytochroomoxidase, d.w.z. het complex IV van de mitochondriale ademhalingsketen. COX5B is betrokken bij de laatste stap van de oxidatieve fosforylering, met de productie van H2O, en het behoud van de elektrochemische gradiënt die nodig is om ATP te produceren. Verlaagde niveaus van ARG2 en COX5B in zinksulfaat-behandelde ratten kunnen dus wijzen op een zink-geïnduceerd effect op de vruchtbaarheid bij zwaarlijvige ratten, vooral in testiculaire regeneratie, spermatogenese, en spermamotiliteit.
Enkele differentieel tot expressie gebrachte eiwitten die in deze studie werden geïdentificeerd zijn betrokken bij het zinktransportproces. Elgazar et al. vonden bijvoorbeeld dat ZnT1 aanwezig is in de plasmamembraan en het cytoplasma van de steuncellen. Studies hebben aangetoond dat Znt1 een belangrijke rol speelt in de zink homeostase bij volwassen muizen. Metaal-responsieve transcriptiefactor-1 (MTF-1) speelt een rol bij de coördinatie van cellulaire reacties op metaalhomeostase en oxidatieve stress. MTF-1 is een zinkafhankelijke transcriptiefactor die genen voor metallothioneïne en zinktransporter-1 (ZNT-1) stimuleert naarmate de zinkconcentratie toeneemt. Foster et al. toonden aan dat de relatieve expressie van zinktransporter-mRNA zeer variabel was. ZnT1 is het meest overvloedig aanwezig in de testis, en het heeft interacties in zinktransport over het plasmamembraan. Noh et al. meldden dat ZnT1 mRNA niveaus licht verhoogd waren bij vrouwen met obesitas, en veranderingen in de zinktransporter kunnen ook geassocieerd zijn met obesitas-gerelateerde ontstekingstoestanden.
De Ly1 antilichaam reactieve homoloog (LYAR) werd voor het eerst beschreven door Su et al. als een cDNA dat codeert voor zinkvingereiwit geïsoleerd uit T-cel leukemielijn van de muis. Het Lyar-gen, waarvan bekend is dat het overvloedig tot expressie komt in de testis, codeert voor een nucleolair eiwit dat een zinkvingermotief van het LYAR-type C2HC en drie nucleaire lokalisatiesignalen bevat. Lee et al. vonden dat het LYAR-eiwit aanwezig was in spermatocyten en spermatiden, maar niet in sperma. Wij ontdekten echter LYAR-expressie in sperma, en de expressie ervan daalde in sperma van zwaarlijvige ratten en steeg in de met ZnSO4 behandelde groepen. LYAR wordt geassocieerd met cytoplasmatische ribosomen in mannelijke kiem- en kankercellen en is betrokken bij preribosomaal RNA-verwerking in de celkern. LYAR is een modulator van één van de twee basisstappen van translatie-initiatie in mannelijke kiemcellen van zoogdieren en bepaalde soorten tumoren. LYAR onderdrukt aanzienlijk de transcriptie van oxidatieve stressgenen, waaronder SLC7A11, HMOX1, en CHAC1. Myc oncoproteïne verhoogt de expressie van LYAR door zijn gentranscriptie te activeren, en de upregulatie van LYAR beschermt op zijn beurt kankercellen tegen oxidatieve stress-gemedieerde apoptose door CHAC1 genexpressie te verminderen.
Transmembraan proteïne 165 (TM165) is een Golgi transmembraan proteïne , en zijn deficiëntie veroorzaakt een aangeboren stoornis van de glycosylatie. TM165 is zowel transcriptioneel als translationeel overgeëxpresseerd in hepatocellulair carcinoom en geassocieerd met het invasief vermogen van hepatocellulair carcinoom. Gegevens verkregen in recente studie geven echter verschillende aanwijzingen van hun implicatie in calcium en mangaan homeostase . TM165 levert Ca2+ en Mn2+ aan het Golgi-complex in ruil voor H+ om de functies van lactose synthase en mogelijk andere glycosyltransferases te ondersteunen. Het menselijke Golgi-eiwit TM165 kan calcium en mangaan transporteren in gist- en bacteriecellen. Uit onze studie bleek dat TM165 expressie in obese ratten afnam en toenam na zinksuppletie, wat suggereert dat TM165 toenam na zinksuppletie.
5. Conclusies
In conclusie leveren de resultaten van deze studie bewijs dat ZnSO4 de hormoonspiegels, testiculaire regeneratie en vruchtbaarheid kan verbeteren. Proteomische analyse toont verder aan dat ZnSO4 de vruchtbaarheid van obese mannelijke ratten kan verbeteren door het reguleren van eiwitexpressie met betrekking tot metabolisme, ontsteking, sperma-rijping, en andere interacties.
Beschikbaarheid van gegevens
De gegevens die worden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek beschikbaar.
Disclosure
De financierende instantie had geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Hebei Provincial Government Funded Clinical Medicine Excellent Talents Training and Basic Research Project (Grant No. 20170183).