Depth of Field

Het gevolg van numerieke apertuur is dat het direct verband houdt met de Depth Of Field (DOF). Voor een gegeven objectief, kijkend naar een monster, is er een bepaald vlak van perfecte focus. De scherptediepte is hoe ver het objectief en het monster zich boven en onder dat vlak kunnen bevinden en toch nog alles scherp hebben.

Hetzelfde gebeurt in de traditionele fotografie, een zeer klein diafragma zal de scherptediepte vergroten. Een groter numeriek diafragma geeft een hogere resolutie, maar de scherptediepte wordt aanzienlijk kleiner. Er is een afstand boven het preparaatvlak en een afstand onder het preparaatvlak, en overal daarbinnen is er in wezen perfecte scherpte. Zodra het objectief en het preparaat zich buiten die grens bevinden, begint het beeld wazig te worden.

Dit wordt de scherptediepte genoemd. De formule voor de scherptediepte is:

waar:
“n” is de brekingsindex van het materiaal tussen het objectief en het monster
λ (lambda) is de golflengte van het licht
NA is de Numerieke Apertuur

In de meeste gevallen is het materiaal tussen het objectief en het monster lucht, en is “n” gelijk aan 1,00. Voor water is de brekingsindex 1,33, en gespecialiseerde immersie-olie voor microscopie is 1,52. Voor een objectief met een lage vergroting, zoals een 4X of zelfs een 10X, is de typische scherptediepte plus of min 3 tot 5 micron. In dat geval, als het monster zeer vlak is, is scherpstellen misschien helemaal niet nodig, of hoeft het maar één keer te gebeuren. In het algemeen variëren de monsters in dikte en variëren zij in vlakheid, zodat scherpstellen nodig is.

Voor 20X vergroting, wat een numerieke apertuur van 0,6 tot 0,8 kan zijn, daalt de scherptediepte tot ongeveer plus of min 500 nanometer. Bij een hoge vergroting met olie-immersie bij een numerieke apertuur van 1,47 daalt de scherptediepte zeer dramatisch, en de scherptediepte kan plus of min 0,1 tot 0,2 micron (100 – 200 nm) bedragen. Dat is een zeer krappe tolerantie. Bij 100 nanometer of 200 nanometer zullen zeer kleine veranderingen in de vlakheid van het monster of de hoogte van het monster, of de nauwkeurigheid van de geleiders van de XY-monsterbewegingsfase, het moeilijk maken om scherp te blijven. Voor het handhaven van de focus in deze situatie, een continu volgen laser auto-focus systeem aangesloten op een hoge bandbreedte objectief focustrap, zoals de DOF-5, is de ideale manier om de focus te handhaven in deze hoge numerieke apertuur, hoge-resolutie toepassingen.