Abstract

Minimum inhibitory concentrations (MIC’s) en minimum fungicidal concentrations (MFC’s) werden bepaald voor 38 oliën van plantaardige oorsprong tegen Candida albicans. In deze studie werden vier stammen gebruikt, waaronder één standaardstam. De antischimmelmiddelen fluconazol en amfotericine B werden gebruikt als positieve controles. De standaardstam (ATCC10231) die in deze studie werd gebruikt, bleek zeer resistent te zijn tegen fluconazol: 3000 μg ml-1 Fluconazol was nodig om de groei van deze stam gedeeltelijk te remmen, en volledige remming kon niet worden bereikt. Andere Candida-stammen waren gevoelig voor 5 μg ml-1 fluconazool. Alle gebruikte stammen waren gevoelig voor amfotericine B. Van de 38 geteste oliën bleken er 23 effectief en 15 ineffectief. Op basis van hun MFC’s werden de effectieve oliën in drie categorieën ingedeeld. Zeven oliën, die een schimmeldodend effect hadden bij minder dan 0,15% concentratie van de oliën, werden ingedeeld in de meest effectieve klasse. De oliën met een MFC tussen 0,16 en 1,5% concentratie werden als matig doeltreffend beschouwd. Negen oliën, die een concentratie van meer dan 1,5% vereisten, werden als minder doeltreffend beschouwd. De fluconazool-resistente stam (MTCC 227) was gevoelig voor ten minste 23 van de plantenoliën. De resultaten van deze studie geven aan dat oliën van plantaardige oorsprong gebruikt kunnen worden als potentiële anti-Candida middelen.

1 Inleiding

Amphotericn B en Fluconazol zijn twee belangrijke middelen die gebruikt worden in de antischimmelchemotherapie tegen humane pathogene schimmels. Amfotericine B wordt gebruikt als het geneesmiddel van keuze bij terminaal zieke patiënten. Het azole geneesmiddel Fluconazol wordt op grote schaal voorgeschreven tegen verschillende Candida albicans infecties. Hoewel deze geneesmiddelen alom geprezen worden om hun werkzaamheid, is bekend dat ze bijwerkingen hebben. Fluconazol is fungistatisch van aard en er zijn berichten over het ontstaan van resistentie tegen fluconazol bij klinische isolaten van C. albicans. Er is dus behoefte aan betere, nieuwe antischimmelmiddelen tegen infecties veroorzaakt door C. albicans die effectief zijn en minder bijwerkingen hebben.

Vele natuurlijke middelen zoals plantaardige producten, waaronder extracten, oliën, enz. worden traditioneel gebruikt tegen verschillende kwalen. Sommige van de plantaardige producten zijn effectief tegen schimmelinfecties en bacteriële infecties. Etherische oliën zoals Tea tree olie, Citroengras olie, Citronella olie, Palmarosha olie en sommige van hun bestanddelen zijn getest tegen de in vitro groei van C. albicans.

We hebben de in vitro werkzaamheid van 38 plantenoliën getest tegen vier isolaten van C. albicans. Minimale remmende concentraties (MIC) en minimale schimmeldodende concentraties (MFC) van de effectieve oliën zijn gerapporteerd. Op basis van hun werkzaamheid (MFC) worden de oliën in drie categorieën ingedeeld.

2 Materialen en methoden

2.1 Chemicaliën en stammen

Een standaardstam, Type stam ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), een referentiestam voorgesteld voor Amphotericine B assay, en drie klinische isolaten van C. albicans werden in deze studie gebruikt. De drie klinische isolaten van C. albicans, nl. SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), werden verkregen van het SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). India. De standaardstam werd aangekocht bij The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, India.

Achtendertig plantaardige oliën werden in deze studie gebruikt. Sommige oliën werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, India, en de overige oliën en de antischimmelmiddelen, Amphotericine B en Fluconazol, werden op de plaatselijke markt gekocht.

2.2 Bereiding van de inocula

Alle in deze studie gebruikte stammen van C. albicans werden gekweekt bij 30 °C gedurende 24 uur in een schuddende incubator met behulp van Yeast Extract Peptone-medium en Sabouraud Dextrose-medium. De cellen werden geoogst door centrifugatie, gesuspendeerd in steriel gedestilleerd water en onmiddellijk gebruikt. Het celgetal werd bepaald met behulp van een hemocytometer en op 5 × 106 kve ml-1 gebracht.

2.3 Screening van plantoliën op anti-Candida-activiteit door schijfdiffusiebeproeving

De anti-Candida-activiteit van 38 plantoliën werd getest door standaard schijfdiffusiebeproeving. De Sabouraud Dextrose Agar-platen werden bereid en bezaaid met 5 × 106 kve ml-1 met behulp van de inocula van Candida-stammen bereid als hierboven. Aseptisch werd 5 μl plantaardige olie op 5-mm filtreerpapierschijfjes (Whatman nr. 1) gespot. Deze schijven werden vervolgens overgebracht naar het midden van de met zaad belegde platen. Voor elke concentratie werden drie platen gebruikt en geïncubeerd bij 30 ± 2 °C. De diameter van de remmingszone werd gemeten na 48-uurs incubatie.

2.4 Bepaling van de minimale remmende concentratie (MIC) van plantaardige oliën door agarverdunningsmethode

Minimale remmende concentraties (MIC’s) van plantaardige oliën werden bepaald door agarverdunningstest (23) De agarplaten werden bereid door YPD-agar met verschillende concentraties plantaardige oliën (d.w.z. 0,03-3% v/v) toe te voegen. Tween 20 0,5% (v/v) werd toegevoegd om de oplosbaarheid van de olie te verbeteren. Deze platen werden geënt met 103 kve, waarbij gebruik werd gemaakt van de inocula van Candida-stammen die op de hierboven beschreven wijze waren bereid. De platen werden voor elke concentratie in drievoud bewaard. Platen met Tween 20 maar zonder enige plantaardige olie werden als controle gebruikt. Al deze platen werden geïncubeerd bij 30 ± 2 °C. De platen werden geobserveerd en het aantal kolonies werd geteld na 48 uur incubatie. De MIC-waarden werden bepaald als de laagste concentratie olie die zichtbare groei van Candida-stammen verhindert.

2.5 Bepaling van de minimale fungicide concentratie (MFC) van plantaardige oliën met behulp van Broth macro-verdunningsmethode

Minimale fungicide concentratie (MFC) van plantaardige oliën werd bepaald door Broth macro-verdunningsassay (NCCLS M27-A, referentiemethode aanbevolen voor het testen van de antischimmelgevoeligheid van gist). Een reeks concentraties (0,03-3% v/v) van plantenolie werd bereid in YPD-bouillonmedium in kolven. Tween 80 werd toegevoegd in een eindconcentratie van 0,001% (v/v) om de oplosbaarheid van de olie te verbeteren. Elke kolf werd geënt met 5 × 105 kve ml-1 van de Candida-stammen. Flesjes met Tween 20 maar zonder enige plantaardige olie werden als controle gebruikt. De kolven werden gedurende 48 uur geïncubeerd bij 30 ± 2 °C in een orbitaal schuddende incubator (100 rpm). Van elke kolf werd 5 μl cultuur geïnoculeerd op YPD-platen en bij 30 ± 2 °C geïncubeerd gedurende 48 uur. De platen werden geobserveerd en MFC’s werden bepaald als de laagste concentratie van de plantolie die de groei van Candida-stammen volledig remt.

3 Resultaten

3.1 Screening van plantoliën op anti-Candida-activiteit

De geteste isolaten van C. albicans toonden verschillende gevoeligheid voor de oliën. Het merendeel van de oliën werd echter effectief bevonden en vertoonde een aanzienlijke activiteit bij zeer lage concentraties. Vijfentwintig van de 38 geteste oliën veroorzaakten een 1-30 mm remmingszone (ZOI). Zeventien oliën veroorzaakten een ZOI van 10-20 mm. Zes oliën vertoonden een ZOI van 1-9 mm tegen alle vier geteste stammen. Jasmijn- en lavendelolie remden de groei van de Candida-stammen niet, behalve CA IV. (Tabel 1). (13 oliën slaagden er niet in de groei van de C. albicans-stammen te remmen bij doses van 5 μl.)

3.2 Bepaling van MIC van plantenoliën tegen C. albicans

MIC’s van de 23 effectieve oliën en twee veel voorgeschreven geneesmiddelen, Fluconazol en Amphotericine B, werden bepaald tegen de vier isolaten van C. albicans. De oliën vertoonden een concentratie-afhankelijke remming van de groei. In enkele gevallen vertoonden de geteste stammen een verschillende gevoeligheid, maar er was geen aanzienlijk verschil in MIC (tabel 2).

Alle vier isolaten bleken gevoelig voor amfotericine B. Een concentratie van 2,5 μg ml-1 amfotericine B was voldoende om de groei van stam CAI en stam CA IV (ATCC10231) volledig te remmen. Stam CA II en CA III hadden 3 μg ml-1 Amphotericine B nodig voor totale groeiremming (tabel 2).

De respons op Fluconazol bleek uiteen te lopen. Stam Ca III was het gevoeligst en slechts 2 μg ml-1 concentratie Fluconazol was voldoende voor een volledige groeiremming. De stammen CA I en CA II hadden 5 μg ml-1 Fluconazool nodig voor een volledige groeiremming (tabel 2). Stam CA IV was zeer resistent tegen fluconazool: 3000 μg ml-1, d.w.z. 1500-maal de MIC van stam CA III, was nodig voor een gedeeltelijke groeiremming. Volledige groeiremming kon bij deze stam zelfs bij een zeer hoge concentratie niet worden bereikt.

Een concentratie van 0,01% kaneelolie was voldoende om de groei van alle vier isolaten volledig te remmen. Jasmijn- en lavendelolie veroorzaakten slechts een lichte remming van de groei en slaagden er niet in de groei volledig te remmen. Zeven oliën remden de groei van de C. albicans-stammen volledig, bij een concentratie van 0,03-0,15%. Voor 11 oliën varieerde de MIC van 0,16% tot 1,0%. Vijf oliën vereisten een concentratie van meer dan 1,0% (tabellen 2 en 3).

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

(

),

–

.

(

)

.

(

). >

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.In:

, pp.

–

.

,

.