De sluizen van het kanaal werken door zwaartekrachtstroming van water uit de meren van Gatún, Alajuela en Miraflores, die worden gevoed door de Chagres en andere rivieren. De sluizen zelf zijn van gelijke lengte, breedte en diepte en zijn in paren gebouwd om de gelijktijdige doorvaart van schepen in beide richtingen mogelijk te maken. Elke sluisdeur heeft twee scharnierende deuren, 20 meter breed en 2 meter dik. De deuren zijn tussen 14 en 25 meter hoog en worden aangedreven door elektromotoren die in de sluiswand zijn verzonken. Ze worden bediend vanuit een verkeerstoren, die zich bevindt op de muur die elk sluizenpaar scheidt en van waaruit ook het vollopen of legen van de sluiskolken wordt geregeld. De sluiskolken zijn 300 meter lang, 33 meter breed en 12 meter diep.

Omwille van het delicate karakter van de oorspronkelijke sluismechanismen mogen alleen kleine vaartuigen zonder hulp door de sluizen. Grotere vaartuigen worden geleid door elektrische sleeplocomotieven, die op tandrails op de sluiswanden werken en de schepen in het midden van de sluis houden. Voordat een sluis kan worden binnengevaren, moet een stootketting, die tussen de wanden van de aanloop is gespannen, worden gepasseerd. Als alles goed verloopt, valt deze ketting in de groef op de bodem van het kanaal. Als het schip echter te snel vaart om veilig te zijn, blijft de ketting gespannen en loopt het schip er tegenaan. De ketting, die door een hydraulische machine in de wanden wordt bediend, zal dan door een automatische ontkoppeling langzaam uitlopen totdat het schip tot stilstand is gebracht. Als het schip wegloopt van de slepende locomotief en door de ketting breekt en de eerste sluisdeur ramt, zal een tweede sluisdeur op 15 meter afstand de sluis beschermen en verdere voortgang tegenhouden.

Het derde sluizencomplex van het Derde Sluizencomplex-project, dat in 2007 van start ging, is geïnspireerd op de Berendrechtsluis in Antwerpen, België, en op waterbesparende bassins die in kanalen in Duitsland worden gebruikt. Ongeveer 190.000 ton staal, voornamelijk uit Mexico, is in zwaar gewapend beton gegoten om de sluiskolken aan de Atlantische en de Stille Oceaanzijde te bouwen, en de nieuwe sluisdeuren zijn tot 10 meter breed, 30 meter hoog en 58 meter lang. De nieuwe kamers en bassins, die het water dat uit het Gatún-meer stroomt zullen controleren, zijn ontworpen om de turbulentie van de waterstroom en de verstoring van de doorvoerende schepen tot een minimum te beperken. De bassins werden in juni 2016 voltooid en omvatten 158 kleppen die bestaan uit 20.000 ton constructiemateriaal. Ambtenaren zeggen dat die waterbesparende bassins de grootste ter wereld zijn en een hergebruik van 60 procent van het water mogelijk maken. Terwijl de bestaande sluizen bij elk gebruik 52 miljoen gallon (197 miljoen liter) gebruiken, gebruiken de nieuwe sluizen 48 miljoen gallon (182 miljoen liter).