3.53.4.3 Synthetische Phagentherapie

Bakteriophagen, oder einfach Phagen genannt, haben eine zentrale Rolle in der Entwicklung der Molekularbiologie und der bakteriellen Genetik gespielt und die frühesten Werkzeuge für die Rekombination von DNA-Molekülen, wie Restriktionsenzyme und Ligasen, bereitgestellt. In den letzten zehn Jahren hat die Untersuchung von Phagenresistenz-Mechanismen zur Entdeckung einer der wichtigsten Technologien für SB seit der PCR geführt, nämlich der CRISPR-Nuklease-Systeme, die Bakterien und Archaeen als adaptive Abwehr gegen exogene DNA entwickelt haben. Die jüngste Identifizierung zahlreicher anderer, bisher nicht charakterisierter Antiphagensysteme könnte weitere bahnbrechende Technologien für SB-Anwendungen liefern.45 In diesem historischen Kontext ist es nur folgerichtig, dass SB nun auf Phagen angewendet wird, um deren Einsatz als Therapeutika zu perfektionieren.

Phagen wurden unabhängig voneinander von Frederik Twort und Félix D’Hérelle Anfang des 20. Jahrhunderts entdeckt46,47 und bald darauf als antimikrobielle Mittel zur Behandlung von Infektionskrankheiten wie Cholera und Pest eingesetzt. In Osteuropa setzte sich die Phagentherapie durch, und bis heute gibt es mehrere renommierte Behandlungszentren, z. B. in Georgien und Polen. Im Westen geriet die Phagentherapie nach einigen sporadischen Anfangserfolgen in Vergessenheit, als Antibiotika allgemein verfügbar wurden. Heute, mit dem Aufkommen antimikrobiell resistenter Krankheitserreger, zunächst der so genannten ESKAPE-Stämme48 , jetzt aber einer noch breiteren Palette von Krankheitserregern49 , die bis 2050 voraussichtlich zu mehr Todesfällen als durch Krebs führen werden, besteht wieder Interesse an der Phagentherapie.

Der Einsatz von Phagen hat gegenüber Antibiotika mehrere Vorteile, vor allem die Möglichkeit, auf spezifische Stämme abzuzielen und dabei die nützliche mikrobielle Gemeinschaft intakt zu lassen, sowie die Möglichkeit, Resistenzen durch die Verwendung von ergänzenden Phagencocktails, das „Training“ von Phagen auf ausgewählten Wirtsstämmen oder die einfache Isolierung neuer Phagen gegen einen Erreger zu überwinden. Damit die Phagentherapie zu einem zuverlässigen Medikament wird und im Westen breite Akzeptanz findet, müssen jedoch noch einige Hürden überwunden und Verbesserungen vorgenommen werden. Dazu gehören: aussagekräftige klinische Studien mit angemessenen Kontrollen, die Verkürzung der Zeit für die Identifizierung von Phagen mit dem geeigneten Wirtsspektrum, die Überwindung der Phagenresistenz und der Ausschlussmechanismen des Zielstamms, ohne dass komplexe Cocktails erforderlich sind, die Umgehung unerwünschter Immunreaktionen auf die Phagenpartikel und die Eindämmung der allgemeinen Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen oder bakteriellen Virulenzfaktoren. Selbst bei erfolgreicher Abtötung eines Zielstammes kann die rasche Lyse einer großen Anzahl von Bakterien und die gleichzeitige Freisetzung von Endotoxinen und Superantigenen zu einer starken Entzündungsreaktion und einem ungünstigen klinischen Ergebnis führen.

Die hochgradig modulare Organisation von Phagengenomen und der Aufbau der Phagenstruktur als funktionelle Module, wie Schwanzfasern, Spikes, Schwanzröhren und Kapsid, machen Phagen zu idealen Zielen für SB-Ansätze, in gewisser Weise sind Phagengenome bereits in BioBricks organisiert. Als frühe Vorlage für das Design zukünftiger synthetischer Phagen wurde der filamentöse Phage Pf3 modifiziert, um eine Infektion mit Pseudomonas aeruginosa in einem Mausmodell zu behandeln.50 Ein Gen des Exportproteins von Pf3 wurde durch ein Gen ersetzt, das für die Restriktionsendonuklease BglII kodiert, mit der Begründung, dass (1) dieser Genaustausch Pf3 nicht replikativ macht und damit eine Eindämmungsstrategie einführt, (2) der Phage stabil in einem Wirt vermehrt werden kann, der das BglII-Methylase-Gen enthält, und (3) die BglII Doppelstrangbrüche in der genomischen DNA des Zielstamms katalysieren würde, um ihn abzutöten. Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie war, dass die Behandlung infizierter Mäuse mit dem gentechnisch veränderten Phagen Pf3R oder mit einem lytischen Phagen zu einer vergleichbaren Überlebensrate bei Mäusen führte, die mit einer minimalen letalen Dosis von 3 herausgefordert wurden, aber bei einer minimalen letalen Dosis von 5 war die Überlebensrate mit der Pf3R-Phagen-Therapie deutlich besser. Die Analyse der Serumzytokinwerte zeigte eine verringerte Entzündungsreaktion, was darauf hindeutet, dass das bessere Ergebnis der Pf3R-Behandlungsgruppe auf die effiziente Abtötung des Zielstammes ohne Lyse und Endotoxinfreisetzung zurückzuführen ist.

Die Abtötung von P. aeruginosa durch Pf3R beruht auf dem Wirtsspektrum des Phagen, um die Spezifität des Ziels zu gewährleisten, da man davon ausgeht, dass BglII-Restriktionsstellen in praktisch allen bakteriellen Genomen vorhanden sind. Eine Verbesserung wird durch die bemerkenswerte Entdeckung eines Bakteriophagen nahegelegt, der ein CRISPR/Cas-System aus einer unbekannten Quelle für seinen eigenen Gebrauch erhalten hat.51 Das von einem Phagen kodierte CRISPR/Cas-System ist in der Lage, neue Spacer zu erwerben, und die CAS3-Nuklease wurde auf ein chromosomales Element umgelenkt, das sein Wirt, Vibrio cholera, für die angeborene Immunität verwendet. Im Anschluss an diese Entdeckung wurde das Typ-II-CRISPR-System von Streptococcus pyogenes in den Bakteriophagen M13 mit Spacern eingebaut, um Sequenzen für Antibiotikaresistenz und Virulenzgene in Escherichia coli anzuvisieren, wobei die Autoren diese Vorrichtungen als RNA-gesteuerte Nukleasen (RGNs) bezeichnen.52 Ein RGN war in der Lage, einen Stamm mit einem Einzelnukleotid-Polymorphismus in der DNA-Gyrase, der Chinolon-Resistenz verleiht, auf diskriminierende Weise abzutöten, was die hohe Spezifität dieses Systems zeigt. Außerdem konnten sie in einem künstlichen Konsortium aus drei Bakterienstämmen ausgewählte Stämme abtöten (400- bis 20.000-fache Abtötung im Vergleich zu Kontrollen), während die anderen Konsortiumsmitglieder intakt blieben. Die Spezifität der CRISPR/Cas-vermittelten Abtötung könnte die Phagentherapie über die gezielte Bekämpfung von Krankheitserregern hinaus auf die präzise Modulation des menschlichen Mikrobioms ausweiten, dessen Zusammensetzung über die Darm-Hirn-Achse mit der Prognose für einige Krebsarten und sogar neurologische Erkrankungen wie Autismus, Parkinson und Alzheimer in Verbindung gebracht wird.

Eine ideale synthetische Phagenplattform könnte eine sein, bei der die Bindung an den Wirtsbereich so gestaltet ist, dass sie sehr breit ist, während die Spezifität der gezielten Bekämpfung von Stämmen durch die CRISPR/Cas-Nutzlast gewährleistet ist. Auf diese Weise könnten Phagen ohne weiteres für Behandlungen eingesetzt werden, ohne dass für jeden Erreger ad hoc eine neue Plattform isoliert werden müsste. Darüber hinaus könnte das breite Wirtsspektrum in Verbindung mit CRISPR-Arrays, die auf verschiedene Antibiotikaresistenz- oder Virulenzgene abzielen, den Einsatz einer präsumptiven Phagentherapie ermöglichen, d. h. vor der Identifizierung des Erregers. Zu den Strategien zur Erweiterung des Wirtsspektrums gehören genetische Vorwärtsscreens zur Identifizierung von Phagenrezeptoren und erforderlichen Wirtsfaktoren,53 die Gewinnung von Prophagen-Rezeptor-Bindungsprotein (RBP)-Sequenzen aus bakteriellen Genomen und das Rebooten von synthetischen Phagen, die beispielsweise für Rezeptor-Bindungsprotein-RBP-Bibliotheken für HTS kodieren könnten.54,55 Die Maskierung von Rezeptoren durch Kapseln kann durch die Expression von Exopolysaccharid-hydrolysierenden Enzymen56 und anderen Enzymen zum Abbau von Biofilmen57 überwunden werden, während andere Maskierungsmechanismen und Phasenvariationen in der Rezeptorexpression durch Phagen überwunden werden können, die mit mehreren Schwanzfasern ausgestattet sind, die verschiedene RBPs oder RBPs für nicht-kanonische, hochkonservierte Zelloberflächenziele enthalten. Bakterien setzen zahlreiche Anti-Phagen-Systeme ein, vor allem die angeborene Immunität der Restriktionsmodifikation und die adaptive Immunität von CRISPR/CAS, aber umgekehrt haben auch Phagen mehrere Strategien entwickelt, um diese Systeme zu überwinden, wie z. B. die Verwendung nicht-kanonischer Nukleotide in ihrer DNA, weniger Restriktionsstellen oder Hypermethylierung ihrer Genome und die Abgabe von Proteinen, die Restriktionsenzyme hemmen oder methylierende Enzyme des Wirts verstärken.

Die hier beschriebene synthetische Phagenplattform würde die Notwendigkeit von Phagencocktails vermeiden, für die die Zulassung komplexer sein könnte. Die verbleibenden Ziele für das Phagen-Engineering sind für viele Biologika allgemein, wie z. B. die Stabilität und die Reaktion des Immunsystems. Insbesondere phagozytische Zellen sind für die Beseitigung von Phagenpartikeln aus dem Kreislaufsystem verantwortlich. Lang zirkulierende Phagenmutanten wurden durch eine serielle Passagetechnik58 gewonnen und es wurde festgestellt, dass sie im Hauptkapsidprotein mutiert waren. Später führte eine einzige Aminosäureänderung, ebenfalls in einem Kapsidprotein, die durch direkte genetische Manipulation eingeführt wurde, zu einer 13.000- bis 16.000-fachen Steigerung der Fähigkeit des Phagen, im Kreislaufsystem der Maus zu verbleiben.59 Andere Parameter zur Verbesserung von Phagen als Therapeutika, wie z.B. Herstellung, Formulierung und Verabreichungsweg, fallen wahrscheinlich nicht in den Bereich der SB-Aktivitäten, aber die Lektionen, die aus früheren Arbeiten mit nativen Phagen gelernt wurden, gelten auch für SB-entwickelte Phagen.

In den letzten zehn Jahren, als das Interesse an der Phagentherapie wieder auflebte und sporadisch über erfolgreiche Einzelfälle berichtet wurde, gab es Versuche, kontrollierte klinische Studien durchzuführen, die keine nennenswerten unerwünschten Wirkungen zeigten, deren Wirksamkeit jedoch noch nicht eindeutig nachgewiesen ist. Es wird ein spannender nächster Artikel in der Geschichte der Phagentherapie, die vor über 100 Jahren begann, sein, zu sehen, wie SB-entwickelte Phagen in klinische Studien eintreten.