Eigenschaften und Nachweis von Botulinum Neurotoxin
Die Clostridien produzieren mehr Arten von Proteintoxinen als jede andere Gattung von Mikroorganismen. Das herausragende Merkmal von Clostridium botulinum ist seine Fähigkeit, ein Neurotoxin von außergewöhnlicher Potenz zu synthetisieren. BoNT umfassen eine Familie pharmakologisch ähnlicher Toxine, die sich an periphere cholinerge Synapsen binden und die Acetylcholin-Exozytose an den neuromuskulären Verbindungsstellen blockieren. BoNT werden in Lebensmitteln, im Darm und in Kulturen als Vorläufertoxinkomplexe gebildet, die aus botulinischem Neurotoxin in Verbindung mit ungiftigen Proteinen bestehen. Die ungiftigen Komponenten der Komplexe verleihen dem Neurotoxin nachweislich Stabilität und verhindern die Inaktivierung durch Verdauungsenzyme im Darm.
Die Diagnose von Botulismus erfolgt im Allgemeinen durch die Beurteilung der klinischen Symptome bei Patienten und bei lebensmittelbedingten Ausbrüchen durch die Häufung von Fällen bei einer Gruppe von Personen, die ein gemeinsames Lebensmittel gegessen haben. Bei den meisten Untersuchungen von Botulismus geht es in erster Linie darum, das Vorhandensein von BoNT nachzuweisen, da die Sporen von C. botulinum in der Umwelt weit verbreitet sind und viele Lebensmittel kontaminieren. Der Nachweis von BoNT im Blut, im Mageninhalt und in Lebensmitteln liefert die Bestätigung für Botulismus. Die Isolierung von C. botulinum aus einem verdächtigen Lebensmittel, aus den Fäkalien von Säuglingen mit Botulismus-Symptomen oder aus Wunden liefert den Beweis für die Diagnose von Botulismus. In den meisten Fällen ist dies jedoch keine Bestätigung, da Sporen in Lebensmitteln und gelegentlich auch im Stuhl gesunder Erwachsener gefunden werden.
BoNT wird vorzugsweise mit einem Bioassay des aus einem Lebensmittel oder einer klinischen Probe extrahierten Toxins nachgewiesen. Der Extrakt wird Mäusen intraperitoneal injiziert und die Tiere werden bis zu vier Tage lang regelmäßig auf typische Anzeichen von Botulismus beobachtet. Je nach der vorhandenen BoNT-Menge treten die Botulismus-Symptome in der Regel innerhalb von 4-24 Stunden auf. Zu den charakteristischen Symptomen gehören eine verminderte Beweglichkeit der Tiere, das Sträuben des Fells, Atembeschwerden, eine Kontraktion der Bauchmuskeln, die zu einer „Wespen“-Morphologie führt, gefolgt von Krämpfen und Tod. Tiere mit diesen Anzeichen sterben in der Regel innerhalb von 24-48 Stunden. Bei Tieren, die früher als 2 Stunden oder nach 48 Stunden sterben, sollte davon ausgegangen werden, dass sie einer anderen Substanz als BoNT zum Opfer gefallen sind. Der durch BoNT verursachte Tod wird durch Neutralisierung mit serotypspezifischen Antitoxinen bestätigt.
Komplikationen treten häufig beim Maus-Bioassay von BoNT aus klinischen Proben und aus bestimmten Lebensmitteln auf. Insbesondere Todesfälle, die durch nicht-botulinumwirksame Substanzen verursacht werden, sind häufig. Diese unspezifischen Todesfälle können in der Regel vermieden werden, indem die störende tödliche Substanz bis zu einem Endpunkt verdünnt wird, an dem der Tod durch das stärkere BoNT verursacht wird. Gelegentlich kann mehr als ein BoNT-Serotyp in einer zu analysierenden Probe vorhanden sein, und die Bestätigung würde eine Neutralisierung durch eine Mischung von Antitoxinen erfordern. Bei Lebensmitteln oder klinischen Proben können nicht-botulinumbedingte Todesfälle durch eine Infektion oder durch das Vorhandensein von Endotoxinen auftreten. Infektionserreger können durch Membranfiltration oder durch Zugabe von Antibiotika zu dem zu untersuchenden Extrakt entfernt werden. Extrakte, die Endotoxine enthalten, können im Allgemeinen bis zu einem geeigneten Endpunkt verdünnt werden, oder die Endotoxine können durch Adsorption entfernt werden. Bei Extrakten aus nicht-proteolytischen Stämmen von C. botulinum (Gruppe II) wird die Toxizität durch die Aktivierung durch eine Protease wie Trypsin erhöht. In einigen Lebensmitteln kann Trypsin toxische Peptide erzeugen, weshalb die Reaktion nach 30-60 Minuten durch Zugabe von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor beendet werden sollte.
Lebensfähiges C. botulinum kann aus Lebensmitteln durch Anreicherung in einem geeigneten Wachstumsmedium wie gekochte Fleisch-Glucose-Bouillon oder Medien, die Peptone, Hefeextrakt und Glucose enthalten, isoliert werden. C. botulinum hat einen komplexen Nährstoffbedarf und benötigt für sein Wachstum ein reichhaltiges Medium. Zur Isolierung ist es oft sinnvoll, einen Teil des Lebensmittels oder der klinischen Probe auf 80° oder 60°C zu erhitzen, um nach Sporen der Gruppe I bzw. II von C. botulinum zu selektieren. Gelegentlich wird 50%iges Ethanol verwendet, um vegetative Zellen in Lebensmittelproben zu inaktivieren, die auf C. botulinum der Gruppe II untersucht werden. Nach der Anreicherung wird das Vorhandensein von BoNT wie zuvor beschrieben mit einem Maus-Bioassay untersucht. Selektive Isolierungsagare, die Antibiotika wie Cycloserin, Sulfamethoxazol und Trimethoprim enthalten, wurden für die Isolierung von C. botulinum der Gruppe I aus klinischen Proben verwendet.
Eine Vielzahl immunologischer Methoden wurde für den Nachweis von BoNT entwickelt, aber die meisten sind nicht so empfindlich wie der Maus-Bioassay, und sie haben auch den potenziellen Nachteil, dass sie biologisch inaktives BoNT nachweisen. Es wurden mehrere Fortschritte bei den Enzymimmunoassays (ELISA) gemacht, um diese Nachteile zu mildern, und es ist wahrscheinlich, dass ELISA als Ergänzung, nicht aber als Ersatz für den Maus-Bioassay eingesetzt werden wird.