Abstract
In dieser Studie wird der Mechanismus untersucht, der der verbessernden Wirkung von Zink auf die Fruchtbarkeit bei fettleibigen Ratten zugrunde liegt, und zwar mit Hilfe der Proteomik. Die Auswirkungen von drei verschiedenen ZnSO4-Dosen auf die Spermatogenese und den Hormonspiegel wurden untersucht. Die Spermatogenese der Hoden wurde durch HE-Färbung beobachtet. Der Östrogen- und Testosteronspiegel im Serum wurde mit einem chemilumineszenten Mikropartikel-Immunoassay gemessen. Die Proteomanalyse des Spermas wurde mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie durchgeführt. Die DAVID-Datenbank wurde zur Durchführung der GO-Anreicherungsanalyse und der KEGG-Pfadanalyse der unterschiedlich exprimierten Gene verwendet, und die STRING-Online-Datenbank wurde zur Erstellung eines PPI-Netzwerks genutzt. Die Spermienzahl, die Spermienmotilität und die Testosteronhormone der mit ZnSO4 behandelten Rattengruppe waren erhöht. ZnSO4 verbesserte die Hodenstruktur und die durch Fettleibigkeit verursachten Anomalien der Spermatogenese. Die Proteomanalyse zeigte, dass in insgesamt 6 Spermaproben aus der mit ZnSO4 behandelten Gruppe und den Adipositasgruppen 401 Proteine unterschiedlich exprimiert wurden. Die differenzierten Proteine wurden in die DAVID-Website eingegeben. Die 341 identifizierten Proteine wurden dann nach ihren biologischen Funktionen klassifiziert. Die KEGG-Analyse zeigte, dass die angereicherten Signalwege Glykolyse/Glukoneogenese, Kohlenstoffstoffwechsel, Zitratzyklus, Fettsäurestoffwechsel und Pyruvatstoffwechsel umfassten. Einige Proteine wurden mit Valin-, Leucin- und Isoleucinabbaupfaden in Verbindung gebracht. Die STRING-Analyse ergab 36 Knotenproteine. Die Cytoscape-Analyse zeigte, dass diese Proteine hauptsächlich an neun Netzwerken beteiligt waren, darunter Stoffwechselprozesse, Oxidation-Reduktion, aerobe Atmung, RNA-Spleißen und Glutathion-Konjugation. ZnSO4 kann die Fruchtbarkeit von fettleibigen männlichen Ratten verbessern, indem es die Proteinexpression im Zusammenhang mit Stoffwechsel, Entzündung und Spermienreifung reguliert.
1. Einleitung
Fettleibigkeit wird mit männlicher Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht. Es besteht eine gewisse zeitliche Übereinstimmung zwischen dem Anstieg der männlichen Unfruchtbarkeitsrate, der Abnahme der Spermienqualität und dem Anstieg der Adipositasrate. Fettleibigkeit führt zu pathologischen Veränderungen der Hoden-Ultrastruktur, und die Apoptose der spermatogenen Zellen ist deutlich erhöht. Die Abnahme der Zahl der reifen Spermien kann einer der Gründe für die geringe Spermatogenität fettleibiger Menschen sein.
Bei fettleibigen Menschen gibt es Störungen des Spurenelementstoffwechsels. Der gestörte Spurenelementestoffwechsel im Körper hat entsprechende Auswirkungen auf den Fettstoffwechsel. Im männlichen Fortpflanzungssystem sind Zinkionen vor allem in den Hoden, Nebenhoden, der Prostata und im Sperma verteilt. Zink ist ein Marker für die Funktion der Prostata. Darüber hinaus reguliert es die Funktion der Spermien, fungiert als Kofaktor für die meisten enzymatischen Reaktionen und trägt zur Aufrechterhaltung der Spermienmotilität bei. Zink spielt auch eine wichtige Rolle bei der Hodenentwicklung und der Spermienbildung. Zinkmangel verstärkt die Apoptose von Keimzellen in Mäusehoden erheblich und führt zu einem Stillstand der Spermatogenese und zu Befruchtungsschäden. Studien haben gezeigt, dass fettleibige Männer 3,5-mal häufiger an Oligozoospermie leiden als Männer mit normalem Gewicht. Eine Zinkergänzung kann das Gewicht von fettleibigen Menschen reduzieren. Der Blutzuckerstatus (Nüchternblutzucker), die Blutfettparameter (Gesamtcholesterin, Triglyzeridspiegel, Lipoproteincholesterin hoher Dichte und Lipoproteincholesterin niedriger Dichte) und der Blutdruck werden durch eine Zinksupplementierung verbessert. Ein orales Zinkpräparat kann den Zinkgehalt im Samenplasma verbessern, die Umwandlung des Kernproteins der Spermien (d. h. von Lysin zu Arginin) fördern und die vorzeitige Depolymerisation des Spermienkerns hemmen. Es kann die Beweglichkeit der Spermien und die Samenqualität von unfruchtbaren Patienten ohne offensichtliche Nebenwirkungen verbessern. Die Anwendung der Proteomik zum Verständnis der Auswirkungen der ZnSO4-Behandlung auf die Spermaproteine bei Adipositas ist jedoch noch begrenzt und bedarf weiterer Erforschung.
In dieser Studie wurden die Auswirkungen von drei verschiedenen ZnSO4-Dosen auf die Spermatogenese und den Hormonspiegel von adipösen Ratten untersucht. Der Mechanismus, der dieser Wirkung zugrunde liegt, wurde außerdem durch eine Proteomanalyse analysiert.
2. Materialien und Methoden
2.1. Tiere
Die 7 Wochen alten Sprague Dawley Ratten (mit einem Gewicht von 180-200 g) wurden vom Experimental Animal Center der Hebei Medical University erworben. Sie wurden bei einem 12-Stunden-Dunkel-Licht-Zyklus in einem klimatisierten Raum (Temperatur, ; Luftfeuchtigkeit, ) mit freiem Zugang zu Wasser und Tierfutter gehalten. Alle Tierversuchsverfahren wurden von der Ethikkommission des Hebei Institute of Family Planning Science and Technology genehmigt.
2.2. Einrichtung des Adipositas-Modells, Einteilung der Tiere und Probenahme
Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: die Gruppe mit normalem Futter (15 Tiere pro Gruppe) und die Adipositas-Modellgruppe (30 Tiere pro Gruppe). Jede Gruppe wurde 8 Wochen lang mit dem entsprechenden Futter gefüttert, d. h. normales Futter für die normale Gruppe und fettreiches Futter für die Fettleibigkeitsmodellgruppe. Die Körpergewichte der Ratten wurden wöchentlich gewogen und 8 Wochen lang aufgezeichnet. Das Adipositasmodell galt als erfolgreich, wenn das durchschnittliche Körpergewicht der Modellgruppe das 1,2-fache des Gewichts der Kontrollgruppe betrug. Die Länge der Ratten wurde gemessen (von der Nasenspitze bis zum Anus), und der Lee-Index wurde nach der Formel
nach der Etablierung des Fettleibigkeitsmodells wurden die Modellratten nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen aufgeteilt: die Fettleibigkeitsgruppe und die mit ZnSO4 behandelte Gruppe. Die Ratten in der mit ZnSO4 behandelten Gruppe erhielten 4 Wochen lang ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) über eine orale Magensonde. Am Ende des Versuchs wurden das Körpergewicht, das Hodengewicht, das Epididymusgewicht und das peritestinale Fett jeder Gruppe gemessen und Blut aus der Bauchaorta entnommen. Die Spermaproben wurden aus den kaudalen Nebenhoden entnommen. Die Hoden wurden entfernt.
2.3. Spermienzahl und Spermienmotilität
Der linke Nebenhoden jeder Ratte wurde unmittelbar nach der Tötung entnommen und in ein Röhrchen mit 1 ml warmer (37°C) Kochsalzlösung überführt. Sie wurden dann 5 Minuten lang bei 37°C geschüttelt, um die Verteilung der Spermatozoen zu ermöglichen. Ungefähr 10 μl der verdünnten Spermasuspension wurden in jede Zählkammer des Hämozytometers gegeben, um die Spermienkonzentration und -beweglichkeit zu bestimmen. Die Motilität wurde als Prozentsatz der beweglichen Spermien (a+b Grad) unter den gesamten Spermien gemessen.
2.4. Bestimmung von Nüchtern-Serumglukose, Blutfetten und Insulin
Gesamtcholesterin, Triglyceride, Lipoprotein niedriger Dichte und Lipoprotein hoher Dichte im Serum wurden mit einem Siemens Centaur XP-Analysegerät mit einem chemilumineszenten Mikropartikel-Immunoassay-Kit (Medical System Biotechnology Co., LTD) gemessen. Die Nüchtern-Serumglukose wurde mit einem Glukose-Nachweiskit (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China) auf einem ACCUTE TBA-40FR-Analysegerät (Toshiba Medical Systems Co., Tokio, Japan) gemessen. Der Insulinspiegel im Serum wurde mittels Chemilumineszenz-Immunoassay auf einem UniCel DxI 800 System (Beckman Coulter, CA, USA) mit entsprechenden Reagenzien (Beckman Coulter, CA, USA) bestimmt.
2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der Leptinspiegel wurde mit ELISA-Kits (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, China) bestimmt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Absorption bei 450 nm abgelesen.
2.6. HE-Färbung
Die Hoden wurden über Nacht in Bouinscher Lösung fixiert. Anschließend wurden die Hoden mit Alkohol dehydriert und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden in 5 μm dicke Schnitte geschnitten und mit HE-Färbung gefärbt. Die Spermatogenese der Hoden wurde unter dem Lichtmikroskop beobachtet.
2.7. Messung der Androgenhormone
Die Östrogen- und Testosteronspiegel im Serum wurden auf einem Siemens Centaur XP-Analysegerät mittels eines chemilumineszenten Mikropartikel-Immunoassays gemessen. Der Nachweiskit wurde von Siemens Healthcare Diagnostic Inc. und Cayman Chemical, Michigan, USA, erworben.
2.8. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie
Die in dieser Studie verwendeten Spermaproteinproben stammten aus den drei Gruppen (normale Gruppe, Adipositas-Modellgruppe und ZnSO4-behandelte Gruppe). Die Spermaproben wurden aus den kaudalen Nebenhoden entnommen. Die Proteine wurden mit Lysatpuffer mit 8 M Harnstoff, 10 mM DTT und Proteaseinhibitor extrahiert. Die Sonikation wurde für 3-5 Minuten durchgeführt. Der Überstand wurde nach 10-minütiger Zentrifugation mit 20000 g bei 4 °C aufgefangen, und die Proteine wurden mit der Bradford-Methode quantifiziert. Die extrahierten Proteine wurden mit 100 mM TEAB auf 100 μL und dann mit 200 mM TCEP bei 55°C für 1 h inkubiert. Danach wurden 5 μL 375 mM Iodacetamid (IAA) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation im Dunkeln wurde vorgekühltes Aceton hinzugefügt und über Nacht bei -20 °C inkubiert. Der Überstand wurde nach 10-minütiger Zentrifugation mit 8000 g bei 10 °C sorgfältig entfernt, und das Lysat wurde bei Raumtemperatur 2-3 Minuten lang getrocknet. Schließlich wurden 100 μg Protein, 100 μl 100 mM TEAB-Lösung und Trypsin-Enzymverhältnis Protein (1 : 50) zusammengemischt und der Enzymverdau über Nacht bei 37°C durchgeführt.
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie: Teilweise verdaute Proben wurden entnommen und in Lösung A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA) gelöst. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 20000 g wurde der Überstand entnommen und die Proteinsequenz mit dem EASY-nLC liquid phase-Q Exactive Massenspektrometer (American Thermo Fisher) nachgewiesen.
Die Bedingungen für die Massenspektrometrie waren 90 min für die Datenerfassungszeit, 2 kV für die Sprühspannung, 320°C für die Kapillartemperatur, 27% für die normalisierte Kollisionsenergie und 300-1400 Da für den Massenbereich der Sammlung. Die primären Parameter waren 70000 für die Auflösung, 36 für das AGC-Ziel, 60 ms für die maximale IT und das Profil für den Spektrumsdatentyp. Die sekundären Parameter waren 17500 für die Auflösung, 54 für das AGC-Ziel, 80 ms für die maximale IT und 3,0 m/z für das Isolationsfenster.
2.9. Data Retrieval
In der Suchmaschine MaxQuant 1.5.2.8 beträgt der erste Fehler 20 ppm, der zweite Fehler 0,02 Da. Die fixe Modifikation ist wie folgt. Cystein ist zu Carbamidomethyl-Cys modifiziert, und die variable Modifikation ist wie folgt: Oxidation-M, LysisC oder Trypsin, oder Glu-C-Verdau. Der enzymatische Verdau erlaubt bis zu 2 fehlende Stellen. Das Füllen von Datenlücken, die Normalisierung und das Differenzscreening () wurden mit den Standardeinstellungen der Perseus-Software durchgeführt. Insgesamt wurden 1344 Proteine in 6 Proben aus beiden Gruppen identifiziert und quantifiziert. Die qualitativen und quantitativen Informationen der Zn- und G-Gruppe über die Differenzproteine wurden ermittelt. Die Perseus-Software führte Tests und Signifikanzanalysen zu den quantitativen Ergebnissen und Verhältnissen der Proteine durch. Die erhaltene Liste der differentiellen Proteine sieht wie folgt aus: insgesamt 401 signifikante differentielle Proteine wurden durch die Ergebnisse des Tests und der Analyse der differentiellen Verteilung erhalten.
2.10. GO (Gene Ontology) und KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Analyse
Die differentiellen Proteine wurden in die DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) Website (https://david.ncifcrf.gov/) für die grundlegende bioinformatische Extraktion importiert. Die von DAVID zur Verfügung gestellten Web-Tools wurden verwendet, um nach funktionellen Annotationsbegriffen und -wegen zu suchen, die in den oben identifizierten Proteinen angereichert waren, einschließlich zellulärer Komponenten, molekularer Funktionen und biologischer Prozesse.
2.11. Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse
Die untersuchten differentiellen Proteine wurden zur Analyse in die Online-Datenbank STRING (https://string-db.org/) importiert. Die Karte des differentiellen Geninteraktionsnetzwerks wurde gezeichnet. Die interaktiven Netzwerkdaten wurden in die Software Cytoscape 3.2 exportiert, um den zentralen Netzwerkknoten zu bestimmen.
2.12. Statistische Analyse
Daten wurden als angezeigt. Die statistische Analyse wurde in SPSS22.0 unter Verwendung einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, wobei ein Wert < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde.
3. Ergebnisse
3.1. Sperma-Parameter und Veränderungen des Testosteron-Hormonspiegels im Sperma nach ZnSO4-Behandlung
Im Vergleich zur Kontrollgruppe stiegen das Körpergewicht, das peritestinale Fett, der Lee-Index, die Gesamtcholesterine, die Triglyceride, das High-Density-Lipoprotein und das Leptin der Ratten der Adipositas-Gruppe sowie das Leptin der mit ZnSO4 behandelten Gruppe deutlich an. Im Vergleich zur Kontrollgruppe nahm das Low-Density-Lipoprotein der fettleibigen Ratten signifikant ab. Im Vergleich zur Adipositasgruppe sanken das Körpergewicht, das peritestinale Fett und der Lee-Index in der mit ZnSO4 behandelten Gruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (Tabelle 1). Um die Auswirkungen von ZnSO4 auf die Fruchtbarkeit von Ratten festzustellen, wurde jede Gruppe von Spermaparametern zunächst nach den Kriterien der WHO 2010 bewertet. Die Anzahl der Spermien und die Spermienmotilität waren in der Adipositasgruppe gehemmt, wie in Tabelle 2 dargestellt. Im Vergleich zur Adipositas-Gruppe stiegen die Spermienzahl und die Spermienmotilität der mit ZnSO4 behandelten Ratten an, was darauf hindeutet, dass ZnSO4 die Spermienparameter bei adipösen Ratten verbessert. Fettleibigkeit selbst kann zu einem Anstieg der Blutfette führen, aber unsere Ergebnisse zeigten, dass die Blutzucker-, Blutfett- und Insulinwerte nicht das Niveau von Diabetes erreichten. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Störfaktoren für diabetische Komplikationen ausgeschlossen wurden. Außerdem haben wir den Serumtestosteronspiegel bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Testosteronhormone in der mit ZnSO4 behandelten Gruppe im Vergleich zur Adipositas-Gruppe anstiegen (Tabelle 2). Somit konnte die Behandlung mit ZnSO4 die Samenqualität von fettleibigen Ratten verbessern.
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Anmerkung: # im Vergleich zur normalen Kontrolle; im Vergleich zur Fettleibigkeit.
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Anmerk: Im Vergleich zur normalen Kontrolle; im Vergleich zur Fettleibigkeit.
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3.2. Die ZnSO4-Behandlung verbessert die Erholung der durch Fettleibigkeit verursachten Hodenbeeinträchtigung
Anschließend führten wir eine histologische Analyse des Hodengewebes durch, deren Ergebnisse in Abbildung 1 dargestellt sind. Der Hodenhistologie zufolge zeigte die normale Gruppe eine normale Spermatogenese (Abbildungen 1(a) und 1(d)), während die Adipositasgruppe eine gestörte Spermatogenese aufwies, da das Lumen der Hodenkanälchen fast leer war (Abbildungen 1(b) und 1(e)). Wie erwartet, zeigte die mit ZnSO4 behandelte Gruppe im Vergleich zur Adipositasgruppe eine signifikante Verbesserung der Hodenhistologie mit dem Auftreten normaler Sertoli- und Leydig-Zellen und einer ungestörten Spermatogenese (Abbildungen 1(c) und 1(f)). Somit kann ZnSO4 die Hodenstruktur und die durch Fettleibigkeit verursachten Anomalien der Spermatogenese verbessern.
3.3. Klassifizierung von 341 Spermaproteinen durch Bioinformatik: Zelluläre Komponente, molekulare Funktion und biologischer Prozess
Um die differenziell exprimierten Proteine zu bestimmen, wurde eine Proteomanalyse durchgeführt. Insgesamt wurden 1344 Proteine in 6 Spermaproben aus der mit ZnSO4 behandelten Gruppe und der Adipositas-Gruppe identifiziert und quantifiziert. Mit der Perseus-Software wurden die quantitativen Ergebnisse und die Verhältnisse der Proteine auf ihre Signifikanz hin untersucht. Es wurden insgesamt 401 signifikante Proteine ermittelt. Die Differentialproteine wurden in die DAVID-Website eingegeben, um die Unterschiede in der Proteinfunktion zwischen der mit ZnSO4 behandelten Gruppe und der Adipositasgruppe zu ermitteln. Bei der GO-Klassifizierung wurden 371 Proteine analysiert, und 30 Proteine stimmten nicht überein. Die 341 identifizierten Proteine wurden dann nach ihren biologischen Funktionen klassifiziert. Wir nutzten die von DAVID bereitgestellten Webtools, um nach funktionellen Annotationsbegriffen und Pfaden zu suchen, die in den oben identifizierten Proteinen angereichert waren. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Abbildung 2 dargestellt. Wir konzentrierten uns auf die Ontologie der zellulären Komponente, der molekularen Funktion und des biologischen Prozesses für die Analyse der Anreicherung von funktionellen Annotationsbegriffen mit und .
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
In der Gruppe „zellulärer Bestandteil“ (Abbildung 2(a)) zeigte die Kategorienanalyse, dass 59% der Proteine mit signifikanten Unterschieden Organellenbestandteile waren, und 60,7% davon waren Organellenbestandteile. Darüber hinaus gehörten 29,6 % der Proteine zu einem makromolekularen Komplex. Die GO-Term-Analyse der „molekularen Funktion“ ergab, dass 22 % der Proteine als Proteine mit katalytischer Aktivität klassifiziert wurden (Abbildung 2(b)). Die übrigen Proteine konnten als proteinbindend, rRNA-bindend und enzymbindend klassifiziert werden. In der Datenbank für „biologische Prozesse“ (Abbildung 2(c)) waren die meisten der 24 % Proteine mit Stoffwechselprozessen verbunden. Außerdem wurden Proteine mit Transport, Signaltransduktion, Zelltod, Zelladhäsion, Immunsystemprozessen und Reproduktion in Verbindung gebracht. Die Ergebnisse der Signalweganalyse (Abbildung 2(d)) mit konzentrierten Proteinen und Anreicherungen sind wie folgt. Mehrere Stoffwechselwege wie Glykolyse/Gluconeogenese, Kohlenstoffstoffwechsel, Zitratzyklus (TCA-Zyklus), Fettsäurestoffwechsel und Pyruvatstoffwechsel wurden gestört und beeinträchtigt, und es wurde gezeigt, dass einige Proteine mit Valin-, Leucin- und Isoleucinabbauwegen in Verbindung stehen.
3.4. Zinkeffekte werden durch differentiell exprimierte Spermaproteine weiter identifiziert
Die Quantifizierungsanalyse wurde durchgeführt, um die Proteinspiegel zwischen den drei Gruppen zu vergleichen. Bei den differentiell exprimierten Proteinen wurden Stoffwechselproteine, mit dem Zintransport assoziierte Proteine und Knotenproteine im Netzwerk ausgewählt (Tabelle 3). Die Proteine mit statistisch signifikanten Veränderungen sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Proteine waren ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR und TM165. Im Vergleich zur Adipositasgruppe war die Expression von ARG2, COX5B und ZNT1 in der mit ZnSO4 behandelten Gruppe signifikant verringert, während die Expression von LYAR und TM165 signifikant erhöht war.
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3.5. Das differentielle Proteininteraktionsnetzwerk wird mithilfe der STRING-Netzwerkdatenbank erstellt
STRING ist eine Online-Analysesoftware, die die Interaktion zwischen bekannten Proteinen analysiert und vorhersagt. Die STRING-Software erstellt einen Scoring-Mechanismus, um verschiedene Datenquellen entsprechend zu gewichten und schließlich einen umfassenden Score zu erstellen und dann eine Netzwerkkarte der Protein-Protein-Interaktionen zu konstruieren. Die 341 untersuchten differentiellen Proteine wurden zur Analyse in die Online-Datenbank STRING (http://string-db.org/) importiert, und es wurden 341 Proteine identifiziert und die Karte der differentiellen Geninteraktionsnetzwerke erstellt. Danach wurden die interaktiven Netzwerkdaten in die Cytoscape 3.2 Software exportiert, um das Netzwerkzentrumsprotein zu bestimmen. Es ist zu erkennen, dass das Netzwerk der differentiellen Proteinzusammensetzung komplex ist (Abbildung 4). Wir verwendeten dann das Cytoscape-Plugin, um die Knotenproteine im Netzwerk zu analysieren, und insgesamt 36 Knotenproteine wurden aus der Analyse erhalten (Tabelle 3). Aus einer Liste von Top-Netzwerken, die mit STRING erstellt wurden, wählten wir die Subnetzwerke aus. Die Cytoscape-Analyse zeigte, dass diese Proteine hauptsächlich an neun Netzwerken beteiligt waren, darunter Stoffwechselprozesse, Oxidation-Reduktion, aerobe Atmung, RNA-Spleißen und Glutathion-Konjugation.
4. Diskussion
Die WHO definiert eine Person mit abnormaler oder übermäßiger Fettansammlung als übergewichtig oder fettleibig, und dieser Zustand stellt eine wachsende Bedrohung für die Gesundheit der Menschen weltweit dar. Aus einigen Berichten geht hervor, dass die Fettleibigkeit rasch zunimmt, was nicht nur das Krankheitsrisiko erhöht, sondern auch das Risiko der Patienten, Fortpflanzungsstörungen zu entwickeln. Da sich die Fortpflanzungsfähigkeit von Männern weltweit verschlechtert, haben immer mehr Menschen erkannt, dass Fettleibigkeit die Qualität der Spermien verringert. Mit steigendem BMI verändern sich die Samenparameter, wodurch sich die physikalische und molekulare Struktur der Spermien verändert. Frühere Studien haben ergeben, dass die Spermienkonzentration und die Gesamtzahl der beweglichen Spermien durch einen hohen BMI negativ beeinflusst werden. In der vorliegenden Studie zeigten die Ratten in den Adipositasgruppen eine signifikante Abnahme der Spermienkonzentration und der Spermienmotilität im Vergleich zu denen in der Normalgewichtsgruppe, während ZnSO4 die Spermienparameter im Vergleich zur Adipositasgruppe verbesserte.
Ungleichgewichte der Sexualhormone können die männliche Fortpflanzung beeinträchtigen, und ein übergewichtiger Status kann den Hormonspiegel bei Männern beeinflussen. Gleichzeitig haben Studien gezeigt, dass Adipositas in engem Zusammenhang mit endokrinen Störungen, wie z. B. Anomalien der Sexualhormone, steht. Fettleibigkeit bei Männern wirkt sich aufgrund von Veränderungen des Hormonspiegels negativ auf das männliche Fortpflanzungspotenzial aus. Daher haben wir die Serumspiegel in jeder Gruppe untersucht. Die Testosteronhormone stiegen in der mit ZnSO4 behandelten Gruppe im Vergleich zur normalen und zur fettleibigen Gruppe an. Es scheint, dass die ZnSO4-Behandlung die Androgenhormonspiegel signifikant erhöhte, so dass sie dem Niveau der normalen Kontrollgruppe entsprachen. Die Verringerung des Körpergewichts und der Blutfettwerte bei den mit ZnSO4 behandelten Ratten könnte zu einer Reparatur der Leydig-Zellen und damit zu einer Erhöhung des Testosteronspiegels führen. Infolgedessen kann ein funktionsfähiges männliches Fortpflanzungssystem wiederhergestellt werden, das die Spermatogenese und die Regeneration der Hodenstruktur unterstützt. Offensichtlich hat sich die Histologie der mit ZnSO4 behandelten Gruppe verbessert, wobei sich die Sertoli- und Leydig-Zellen regenerierten und die Spermien im Lumen wiederhergestellt wurden. Daher bietet eine groß angelegte vergleichende Proteomik einen effektiven Ansatz zur Identifizierung von Unterschieden in der Proteinexpression zwischen der fettleibigen und der mit ZnSO4 behandelten Gruppe. In unserer Studie wurden die Unterschiede in den Proteinexpressionsprofilen zwischen normalen fruchtbaren Spermien und Spermien aus ZnSO4-behandelten Gruppen identifiziert.
Die GO-Annotationsanalyse zeigte, dass 24 % der Proteine mit metabolischen Prozessen in Verbindung standen und 22 % der Proteine als Proteine mit katalytischer Aktivität klassifiziert wurden. Die anderen Proteine wurden als proteinbindend, rRNA-bindend und enzymbindend, einschließlich ATP-bindend, klassifiziert. Es ist bekannt, dass ATP-bindende Proteine eine grundlegende Rolle in biologischen Prozessen spielen, was auf Veränderungen in synthetischen und metabolischen Prozessen hinweist. Mitochondrien sind Organellen, die Zellen mit Energie (ATP) versorgen. Mitochondrien sind auch das primäre Ziel von oxidativem Stress. Im männlichen Körper sind die Mitochondrien die Hauptenergiequelle im Prozess der spermatogenen Zellreifung und liefern auch Energie für die Spermien nach der Ejakulation. Wenn bei fettleibigen Männern oxidativer Stress auftritt, können die Mitochondrien in den Spermien daher stark geschädigt werden. Spermien sind anfällig für oxidativen Stress und verfügen nicht über die Fähigkeit, Schäden zu reparieren. Eine fettreiche Ernährung führt bei fettleibigen Ratten zu oxidativem Stress, der die mitochondriale Membran der Spermien schädigt und die mitochondriale Funktion beeinträchtigt. Egwurugwu et al. kamen zu dem Schluss, dass Zinksulfat in physiologischen Dosen einige signifikante positive Auswirkungen auf Androgen und Spermienqualität hat. Bei höheren Dosen war es jedoch schädlich.
ARG2 ist dafür bekannt, dass es in Mitochondrien lokalisiert ist. Es spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Produktion von Ornithin, einer Vorstufe von Prolin, Hydroxyprolin und Polyamin, und ist für die Zellproliferation unerlässlich. Adipositas und die damit verbundenen Krankheiten sind durch ein hohes Maß an chronischen Entzündungen gekennzeichnet. ARG2 fördert proinflammatorische Reaktionen in Makrophagen und trägt zu Anzeichen von Atherosklerose und adipositasbedingter Insulinresistenz bei. Wir glauben, dass eine frühe Adipositas zu einer Hochregulierung von Arginase führen kann, was zu systemischen Veränderungen von Arginase und Argininmetaboliten führt. Die Hochregulierung von ARG2 in der fettleibigen Gruppe könnte mit der Zellproliferation und der durch Fettleibigkeit verursachten chronischen Entzündung zusammenhängen. Arginase verbessert fettleibigkeitsbedingte Leberfett- und systemische Fettanomalien, indem es die Aktivierung von Signalwegen hemmt, die am hepatischen Triglycerid-Stoffwechsel und an der mitochondrialen Funktion beteiligt sind.
Von diesen Proteinen ist insbesondere COX5B von großem Interesse und mit der mitochondrialen Funktion und der zellulären Energieproduktion verbunden. Die Cytochromoxidase (COX, Komplex IV) ist ein Enzym der mitochondrialen Elektronentransportkette, das sich in der inneren Membran der Mitochondrien befindet und dessen Aktivität für die Erzeugung der Protonenmotivkraft erforderlich ist, die die nachgeschaltete ATP-Synthese antreibt. Es ist eine der drei mitochondrialen Isoformen der Cytochromoxidase, d. h. des Komplexes IV der mitochondrialen Atmungskette. COX5B ist am letzten Schritt der oxidativen Phosphorylierung mit der Produktion von H2O und der Aufrechterhaltung des elektrochemischen Gradienten beteiligt, der für die Produktion von ATP erforderlich ist. Somit könnten die verringerten Konzentrationen von ARG2 und COX5B bei mit Zinksulfat behandelten Ratten auf eine zinkinduzierte Auswirkung auf die Fruchtbarkeit bei fettleibigen Ratten hindeuten, insbesondere auf die Hodenregeneration, die Spermatogenese und die Spermienmotilität.
Einige der in dieser Studie identifizierten differentiell exprimierten Proteine sind am Zintransportprozess beteiligt. So fanden Elgazar et al. heraus, dass ZnT1 in der Plasmamembran und im Zytoplasma der Stützzellen vorhanden ist. Studien haben gezeigt, dass Znt1 eine wichtige Rolle bei der Zinkhomöostase in erwachsenen Mäusen spielt. Der metallabhängige Transkriptionsfaktor 1 (MTF-1) spielt eine Rolle bei der Koordinierung der zellulären Reaktionen auf Metallhomöostase und oxidativen Stress. MTF-1 ist ein zinkabhängiger Transkriptionsfaktor, der mit steigender Zinkkonzentration die Gene für Metallothionein und Zink-Transporter-1 (ZNT-1) stimuliert. Foster et al. wiesen nach, dass die relative Expression von Zink-Transporter-mRNA sehr unterschiedlich ist. ZnT1 kommt in den Hoden am häufigsten vor und ist am Transport von Zink durch die Plasmamembran beteiligt. Noh et al. berichteten, dass die ZnT1-mRNA-Konzentration bei fettleibigen Frauen leicht erhöht war und dass Veränderungen des ZnT1-Transporters auch mit fettleibigkeitsbedingten Entzündungszuständen in Verbindung gebracht werden können.
Das Ly1-Antikörper-reaktive Homolog (LYAR) wurde erstmals von Su et al. als cDNA beschrieben, die für ein Zinkfingerprotein kodiert, das aus einer T-Zell-Leukämie-Linie der Maus isoliert wurde. Das Lyar-Gen, von dem bekannt ist, dass es in den Hoden reichlich exprimiert wird, kodiert ein nukleolares Protein, das ein C2HC-Zinkfingermotiv vom LYAR-Typ und drei Kernlokalisierungssignale enthält. Lee et al. fanden heraus, dass das LYAR-Protein in Spermatozyten und Spermatiden, aber nicht in Spermien vorhanden ist. Wir konnten jedoch die Expression von LYAR in Spermien nachweisen, wobei die Expression in Spermien fettleibiger Ratten abnahm und in mit ZnSO4 behandelten Gruppen zunahm. Es wurde festgestellt, dass LYAR mit zytoplasmatischen Ribosomen in männlichen Keim- und Krebszellen assoziiert ist und an der Verarbeitung präreibosomaler RNA im Zellkern beteiligt ist. LYAR ist ein Modulator eines der beiden grundlegenden Schritte der Translationsinitiation in männlichen Keimzellen von Säugetieren und bestimmten Arten von Tumoren. LYAR unterdrückt in erheblichem Maße die Transkription von Genen für oxidativen Stress, darunter SLC7A11, HMOX1 und CHAC1. Das Myc-Onkoprotein reguliert die LYAR-Expression durch Aktivierung seiner Gentranskription hoch, und die Hochregulierung von LYAR wiederum schützt Krebszellen vor der durch oxidativen Stress vermittelten Apoptose durch Verringerung der CHAC1-Genexpression.
Transmembranprotein 165 (TM165) ist ein Golgi-Transmembranprotein, dessen Mangel eine angeborene Störung der Glykosylierung verursacht. TM165 wird in hepatozellulären Karzinomen sowohl transkriptionell als auch translational überexprimiert und mit der invasiven Fähigkeit hepatozellulärer Karzinome in Verbindung gebracht. Daten aus neueren Studien geben jedoch mehrere Hinweise auf ihre Beteiligung an der Kalzium- und Manganhomöostase. TM165 liefert Ca2+ und Mn2+ an den Golgi-Komplex im Austausch gegen H+, um die Funktionen der Laktose-Synthase und möglicherweise anderer Glykosyltransferasen aufrechtzuerhalten. Das menschliche Golgi-Protein TM165 kann Kalzium und Mangan in Hefe- und Bakterienzellen transportieren. Unsere Studie ergab, dass die Expression von TM165 bei fettleibigen Ratten abnahm und nach einer Zinksupplementierung zunahm, was darauf schließen lässt, dass TM165 nach einer Zinksupplementierung zunahm.
5. Schlussfolgerungen
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass ZnSO4 den Hormonspiegel, die Hodenregeneration und die Fruchtbarkeit verbessern kann. Die Proteomanalyse zeigt außerdem, dass ZnSO4 die Fruchtbarkeit fettleibiger männlicher Ratten verbessern kann, indem es die Expression von Proteinen reguliert, die mit dem Stoffwechsel, Entzündungen, der Spermienreifung und anderen Wechselwirkungen zusammenhängen.
Datenverfügbarkeit
Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage erhältlich.
Bekanntgabe
Die finanzierende Organisation hatte keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.
Dankbarkeit
Diese Studie wurde vom Hebei Provincial Government Funded Clinical Medicine Excellent Talents Training and Basic Research Project (Grant No. 20170183) unterstützt.