Minimum Inhibitory Concentration (MIC) und Minimum Bactericidal Concentration (MBC) Tests definieren die Wirksamkeit eines Testmaterials anhand der Konzentration, bei der es das Wachstum von 1 x 106 (eine Million) Mikroorganismen während einer 18- bis 20-stündigen Inkubationszeit (35 ± 20°C) hemmt (Minimum Inhibitory Concentration, oder MIC) hemmt oder 1 x 106 (eine Million) Mikroorganismen während einer 18- bis 20-stündigen Inkubationszeit (35 ± 2°C) vollständig abtötet (minimale bakterizide Konzentration oder MBC).
Die MHK-Methode misst die Wirkung abnehmender Konzentrationen des Antiseptikums über einen bestimmten Zeitraum in Bezug auf die Hemmung des Wachstums der mikrobiellen Population. Die Konzentration des Arzneimittels, die erforderlich ist, um die Wirkung zu erzielen, wird als Minimale Hemmkonzentration definiert und liegt normalerweise mehrere hundert bis tausend Mal niedriger als die in der fertigen Darreichungsform gefundene Konzentration.
Methods For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Die Standardreferenz, die als Grundlage für die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) verwendet wird, ist die aktuellste Version von Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (derzeit CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) oder anaerob (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & MBC Test Overview
Das Produkt wird seriell im Verhältnis 1:2 in einem Wachstumsmedium verdünnt, das für das Wachstum der einzelnen Mikroorganismen geeignet ist, in der Regel Mueller-Hinton Broth (MHB) oder Mueller-Hinton Agar (MHA), um eine Verdünnungsreihe des Produkts im Medium bis zu einem Verhältnis von 1:32.768 herzustellen (gemäß BSLI SOP L-2045). Je nach Art des Produkts muss die Verdünnungsreihe jedoch nicht so weit durchgeführt werden. Zu den Röhrchen der Serie, die jeweils ein 2,0 mL Aliquot des in Wachstumsmedium seriell verdünnten Produkts enthalten, wird nun 1,0 mL einer 1 x 106 KBE/mL Suspension einer Challenge-Spezies hinzugefügt. Nach der 18- bis 24-stündigen Bebrütung werden die Röhrchen mit der Suspension aus Mikroorganismus, Produkt und Medium untersucht, um die höchste Produktverdünnung (und umgekehrt die niedrigste Produktkonzentration) zu bestimmen, die das Wachstum des Mikroorganismus vollständig hemmt, wie mit bloßem Auge festgestellt werden kann. Dieser Verdünnungswert (und/oder Produktkonzentrationswert) wird als Wert der minimalen Hemmkonzentration aufgezeichnet.
Wird eine MBC-Bestimmung gewünscht, so werden von der Verdünnungssuspension, die die minimale Hemmkonzentration darstellt, und von den zwei oder drei Verdünnungssuspensionen, die der Verdünnung mit der minimalen Hemmkonzentration vorausgehen, abgemessene Mengen auf Platten mit festem Wachstumsmedium übertragen, die dann 24 Stunden lang bei 37E± 2E bebrütet werden. Nach der Bebrütung werden die Platten auf das Wachstum des Testmikroorganismus untersucht. Diejenige Verdünnung des Produkts (und/oder die Produktkonzentration), die kein Wachstum hervorruft, wird als MBC aufgezeichnet. Es ist zu beachten, dass MHK/MBC-Testverfahren unter Verwendung von 1:2-Serienverdünnungen des Produkts in Nährstoffagarmedium (Festphasen-Test) oder unter Verwendung von 1:2-Serienverdünnungen des Produkts in Nährstoffbouillonmedium (Suspensionsphasen-Test) durchgeführt werden können. Sofern der Sponsor nicht ausdrücklich die Agar-Verdünnungsmethode verlangt, führt BSLI die MHK-Tests mit der Makro-Röhrchen-Bouillon-Verdünnungsmethode durch, da diese wesentlich weniger material- und zeitintensiv ist.
Produkte, die im Rahmen einer Arzneimittelprüfung getestet werden
Für Produkte, die im Rahmen einer IND getestet werden müssen, legt die FDA auf Seite 31444 des TFM eindeutig fest, welche Mikroorganismen für den In-vitro-Test der Produkte verwendet werden müssen. Für die Studie zur minimalen Hemmkonzentration gibt das TFM an, dass das fertige Produkt, der Produktwirkstoff und der Produktträger jeweils mit 25 ATCC-Stämmen und 25 frischen klinisch isolierten Stämmen der 12 gramnegativen und 11 grampositiven Bakterienarten und der beiden Hefepilzgruppen (Candida albicans und Candida spp., nicht albicans) getestet werden müssen. Es handelt sich also um eine sehr umfangreiche Studie, bei der 1.250 Stämme der insgesamt 25 Bakterien und Hefen, die in der TFM angegeben sind, mit jeder der drei Produktkonfigurationen getestet werden.
In den letzten Jahren hat die FDA diese schwerwiegende Anforderung etwas gelockert – obwohl das fertige Produkt gegen die 1.250 Stämme getestet werden muss, müssen der Produktwirkstoff und das Produktvehikel nur mit fünf ATCC-Stämmen und fünf frischen klinisch isolierten Stämmen jeder der 25 Bakterien-/Hefearten getestet werden. Dennoch sind es insgesamt 250 Stämme, die sowohl für den Wirkstoff als auch für das Vehikel getestet werden müssen, und die gesamte TFM-MHK-Studie ist ziemlich umfangreich und teuer – insgesamt 1.750 einzelne Bestimmungen der minimalen Hemmkonzentration. Die FDA lässt auch einige Spezies-Substitutionen zu (z. B. andere Bacteroides-Spezies als B. fragilis und andere koagulase-negative Staphylococcus-Spezies als S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus und S. saprophyticus), um dem Mangel an ATCC-Stämmen und/oder klinischen Isolaten einiger der für die TFM erforderlichen Spezies Rechnung zu tragen. In Anbetracht der Tatsache, dass Alkohole im Allgemeinen nach zwei Verdünnungen im Verhältnis 1:2 nicht mehr antimikrobiell aktiv sind, verlangt die FDA keine MHK-Daten für Produkte, in denen ein Alkohol der einzige aktive Bestandteil ist.
MIC & MBC-Konzeptnachweis für Marketingzwecke
Obwohl BSLI einige der von der TFM für IND-registrierte Produkte geforderten vollständigen Studien zur minimalen Hemmstoffkonzentration durchgeführt hat, werden die meisten Studien zur minimalen Hemmstoffkonzentration und gelegentliche MBC-Studien für Konzeptnachweise und Marketingzwecke durchgeführt. Bei dieser Art von Studien empfiehlt das BSLI seinen Kunden im Allgemeinen, ATCC-Stämme aller 25 im TFM aufgeführten Arten/Stämme sowie jeweils ein klinisches Isolat zu testen (d. h. insgesamt 50 Challenge-Stämme).