Schärfentiefe

Die numerische Apertur steht in direktem Zusammenhang mit der Schärfentiefe (DOF). Für ein bestimmtes Objektiv gibt es beim Blick auf eine Probe eine bestimmte Ebene der perfekten Schärfe. Die Schärfentiefe gibt an, wie weit über und unter dieser Ebene das Objektiv und die Probe liegen können, ohne dass alles im Fokus ist.

Das Gleiche geschieht in der traditionellen Fotografie: Eine sehr kleine Blende erhöht die Schärfentiefe. Eine größere numerische Apertur führt zu einer höheren Auflösung, aber die Schärfentiefe wird erheblich kleiner. Es gibt einen Abstand oberhalb der Probenebene und einen Abstand unterhalb der Probenebene, und innerhalb dieser Abstände ist die Schärfe im Wesentlichen perfekt. Sobald sich das Objektiv und die Probe außerhalb dieser Grenze befinden, beginnt das Bild zu verschwimmen.

Dies wird als Schärfentiefe bezeichnet. Die Formel für die Schärfentiefe lautet:

wobei:
„n“ ist der Brechungsindex des Materials zwischen Objektiv und Probe
λ (Lambda) ist die Wellenlänge des Lichts
NA ist die numerische Apertur

In den meisten Fällen ist das Material zwischen Objektiv und Probe Luft, und „n“ ist gleich 1,00. Für Wasser beträgt der Brechungsindex 1,33, und spezielles Immersionsöl für die Mikroskopie hat den Wert 1,52. Bei einem Objektiv mit geringer Vergrößerung, z. B. einem 4X- oder sogar einem 10X-Objektiv, liegt die typische Schärfentiefe bei plus/minus 3 bis 5 Mikrometern. In diesem Fall, wenn die Probe sehr flach ist, ist eine Fokussierung möglicherweise überhaupt nicht erforderlich, oder es muss nur einmal fokussiert werden. Im Allgemeinen variieren die Dicke und die Ebenheit der Proben, so dass eine Fokussierung erforderlich ist.

Bei einer 20fachen Vergrößerung, die einer numerischen Apertur von 0,6 bis 0,8 entsprechen kann, sinkt die Schärfentiefe auf etwa plus oder minus 500 Nanometer. Bei hoher Vergrößerung mit Ölimmersion und einer numerischen Apertur von 1,47 nimmt die Schärfentiefe drastisch ab, und die Schärfentiefe kann plus oder minus 0,1 bis 0,2 Mikrometer (100 – 200 nm) betragen. Das ist eine sehr enge Toleranz. Bei 100 Nanometern oder 200 Nanometern wird es bei winzigen Änderungen der Ebenheit der Probe oder der Höhe der Probe oder der Präzision der Führungen des XY-Probenbewegungstisches schwierig, den Fokus zu halten. Um den Fokus in dieser Situation beizubehalten, ist ein Laser-Autofokussystem mit kontinuierlicher Nachführung, das mit einem Objektivfokussiertisch mit hoher Bandbreite wie dem DOF-5 verbunden ist, der ideale Weg, um den Fokus in diesen Anwendungen mit hoher numerischer Apertur und hoher Auflösung beizubehalten.