Abstract

Minimum inhibitory concentrations (MICs) und minimum fungicidal concentrations (MFCs) wurden für 38 Öle pflanzlichen Ursprungs gegen Candida albicans bestimmt. In dieser Studie wurden vier Stämme, darunter ein Standardstamm, verwendet. Die Antimykotika Fluconazol und Amphotericin B wurden als Positivkontrollen verwendet. Der in dieser Studie verwendete Standardstamm (ATCC10231) erwies sich als sehr resistent gegen Fluconazol: 3000 μg ml-1 Fluconazol waren erforderlich, um das Wachstum dieses Stammes teilweise zu hemmen, und eine vollständige Hemmung konnte nicht erreicht werden. Andere Candida-Stämme waren empfindlich auf 5 μg ml-1 Fluconazol. Alle verwendeten Stämme waren empfindlich gegenüber Amphotericin B. Von den 38 getesteten Ölen erwiesen sich 23 als wirksam und fünfzehn als unwirksam. Auf der Grundlage ihrer MFCs wurden die wirksamen Öle in drei Kategorien eingeteilt. Sieben Öle, die bei einer Ölkonzentration von weniger als 0,15 % eine fungizide Wirkung zeigten, wurden in die wirksamste Klasse eingeteilt. Die Öle, die eine MFC im Bereich von 0,16-1,5% Konzentration aufwiesen, wurden als mäßig wirksam eingestuft. Neun Öle, die eine Konzentration von mehr als 1,5 % aufwiesen, wurden als weniger wirksam eingestuft. Der Fluconazol-resistente Stamm (MTCC 227) war gegenüber mindestens 23 der Pflanzenöle empfindlich. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass Öle pflanzlichen Ursprungs als potenzielle Anti-Candida-Wirkstoffe Verwendung finden könnten.

1 Einleitung

Amphotericn B und Fluconazol sind zwei wichtige Wirkstoffe, die in der antimykotischen Chemotherapie gegen humanpathogene Pilze eingesetzt werden. Amphotericin B wird als Mittel der Wahl bei todkranken Patienten eingesetzt. Das Azol-Medikament Fluconazol wird häufig gegen verschiedene Candida albicans-Infektionen verschrieben. Obwohl diese Medikamente wegen ihrer Wirksamkeit weithin gelobt werden, sind sie für ihre Nebenwirkungen bekannt. Fluconazol ist von Natur aus fungistatisch und es gibt Berichte über das Auftreten von Fluconazol-Resistenzen bei klinischen Isolaten von C. albicans. Daher besteht ein Bedarf an besseren, neuartigen antimykotischen Wirkstoffen gegen durch C. albicans verursachte Infektionen, die wirksam sind und weniger Nebenwirkungen haben.

Viele natürliche Wirkstoffe wie Pflanzenprodukte, einschließlich Extrakte, Öle usw., werden traditionell gegen verschiedene Beschwerden eingesetzt. Einige der pflanzlichen Produkte sind wirksam gegen Pilz- und bakterielle Infektionen. Ätherische Öle wie Teebaumöl, Zitronengrasöl, Citronella-Öl, Palmarosha-Öl und einige ihrer Bestandteile wurden gegen das In-vitro-Wachstum von C. albicans getestet.

Wir haben die In-vitro-Wirksamkeit von 38 Pflanzenölen gegen vier Isolate von C. albicans getestet. Es werden minimale Hemmkonzentrationen (MIC) und minimale fungizide Konzentrationen (MFC) der wirksamen Öle angegeben. Auf der Grundlage ihrer Wirksamkeit (MFC) werden die Öle in drei Kategorien eingeteilt.

2 Materialien und Methoden

2.1 Chemikalien und Stämme

Ein Standardstamm, der Typstamm ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), ein für den Amphotericin B-Test vorgeschlagener Referenzstamm, und drei klinische Isolate von C. albicans wurden in dieser Studie verwendet. Die drei klinischen Isolate von C. albicans, nämlich SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), wurden vom SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). Indien. Der Standardstamm wurde vom Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, Indien, erworben.

Achtunddreißig Pflanzenöle wurden in dieser Studie verwendet. Einige der Öle wurden freundlicherweise vom Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, Indien, zur Verfügung gestellt, die übrigen Öle und die Antimykotika Amphotericin B und Fluconazol wurden auf dem lokalen Markt gekauft.

2.2 Inokulavorbereitung

Alle in dieser Studie verwendeten Stämme von C. albicans wurden bei 30 °C für 24 Stunden in einem Schüttelinkubator unter Verwendung von Hefeextrakt-Pepton-Medium und Sabouraud-Dextrose-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und sofort verwendet. Die Zellzahl wurde mit einem Hämozytometer bestimmt und auf 5 × 106 cfu ml-1 eingestellt.

2.3 Screening von Pflanzenölen auf Anti-Candida-Aktivität durch Scheibendiffusionstest

Die Anti-Candida-Aktivität von 38 Pflanzenölen wurde durch einen Standard-Scheibendiffusionstest getestet. Die Sabouraud-Dextrose-Agar-Platten wurden vorbereitet und mit 5 × 106 cfu ml-1 unter Verwendung der wie oben beschriebenen Inokula von Candida-Stämmen besät. Aseptisch wurden 5 μl der Pflanzenöle auf 5-mm-Filterpapierscheiben (Whatman Nr. 1) getupft. Diese Scheiben wurden dann in die Mitte der besetzten Platten übertragen. Für jede Konzentration wurden drei Platten verwendet und bei 30 ± 2 °C bebrütet. Der Durchmesser der Hemmzone wurde nach 48 Stunden Inkubation gemessen.

2.4 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Pflanzenölen durch Agarverdünnungsmethode

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von Pflanzenölen wurden durch Agarverdünnung bestimmt (23). Zur Verbesserung der Öllöslichkeit wurde Tween 20 0,5% (v/v) zugesetzt. Diese Platten wurden mit 103 cfu beimpft, wobei die wie oben vorbereiteten Inokula von Candida-Stämmen verwendet wurden. Die Platten wurden in dreifacher Ausführung für jede Konzentration aufbewahrt. Platten mit Tween 20, aber ohne Pflanzenöl, wurden als Kontrolle verwendet. Alle diese Platten wurden bei 30 ± 2 °C bebrütet. Die Platten wurden beobachtet und die Anzahl der Kolonien nach 48 Stunden Inkubation gezählt. Die MHK-Werte wurden als die niedrigste Konzentration des Öls bestimmt, die das sichtbare Wachstum von Candida-Stämmen verhindert.

2.5 Bestimmung der minimalen fungiziden Konzentration (MFC) von Pflanzenölen mit Hilfe der Broth-Makroverdünnungsmethode

Die minimale fungizide Konzentration (MFC) von Pflanzenölen wurde mit Hilfe des Broth-Makroverdünnungsassays (NCCLS M27-A, empfohlene Referenzmethode für die antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Hefe) bestimmt. Eine Reihe von Konzentrationen (0,03-3% v/v) des Pflanzenöls wurde in YPD-Bouillonmedium in Flaschen zubereitet. Zur Verbesserung der Öllöslichkeit wurde Tween 80 in einer Endkonzentration von 0,001 % (v/v) zugegeben. Jedes Fläschchen wurde mit 5 × 105 cfu ml-1 der Candida-Stämme beimpft. Flaschen, die Tween 20 enthielten, aber kein Pflanzenöl enthielten, wurden als Kontrolle verwendet. Die Kolben wurden 48 Stunden lang bei 30 ± 2 °C in einem Orbitalschüttelinkubator (100 U/min) bebrütet. Von jedem Kolben wurden 5 μl der Kultur auf YPD-Platten beimpft und 48 Stunden lang bei 30 ± 2 °C bebrütet. Die Platten wurden beobachtet und die MFCs wurden als die niedrigste Konzentration des Pflanzenöls bestimmt, die das Wachstum der Candida-Stämme vollständig hemmt.

3 Ergebnisse

3.1 Screening von Pflanzenölen auf Anti-Candida-Aktivität

Die getesteten Isolate von C. albicans zeigten eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber den Ölen. Die Mehrzahl der Öle erwies sich jedoch als wirksam und zeigte bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen eine beträchtliche Aktivität. Fünfundzwanzig der 38 getesteten Öle verursachten eine 1-30 mm große Hemmzone (ZOI). Siebzehn Öle verursachten eine ZOI von 10-20 mm. Sechs Öle zeigten eine ZOI von 1-9 mm gegen alle vier getesteten Stämme. Jasmin- und Lavendelöl hemmten das Wachstum der Candida-Stämme mit Ausnahme von CA IV nicht. (Tabelle 1). (13 Öle konnten das Wachstum der C. albicans-Stämme bei 5-μl-Dosen nicht hemmen.)

3.2 Bestimmung der MHK von Pflanzenölen gegen C. albicans

Die MHKs der 23 wirksamen Öle und zweier weithin verschriebener Medikamente, Fluconazol und Amphotericin B, wurden gegen die vier Isolate von C. albicans bestimmt. Die Öle zeigten eine konzentrationsabhängige Hemmung des Wachstums. In einigen wenigen Fällen zeigten die getesteten Stämme eine unterschiedliche Empfindlichkeit, aber es gab keinen nennenswerten Unterschied in der MHK (Tabelle 2).

Alle vier Isolate erwiesen sich als empfindlich gegenüber Amphotericin B. Eine Konzentration von 2,5 μg ml-1 Amphotericin B reichte aus, um das Wachstum von Stamm CAI und Stamm CA IV (ATCC10231) vollständig zu hemmen. Die Stämme CA II und CA III benötigten 3 μg ml-1 Amphotericin B für eine vollständige Wachstumshemmung (Tabelle 2).

Die Reaktion auf Fluconazol fiel unterschiedlich aus. Der Stamm Ca III war am empfindlichsten und nur 2 μg ml-1 Fluconazol reichten für eine vollständige Wachstumshemmung aus. Die Stämme CA I und CA II benötigten 5 μg ml-1 Fluconazol () für eine vollständige Wachstumshemmung (Tabelle 2). Der Stamm CA IV war sehr resistent gegen Fluconazol: 3000 μg ml-1, d. h. das 1500-fache der MHK von Stamm CA III, waren für eine teilweise Wachstumshemmung erforderlich. Eine vollständige Wachstumshemmung konnte bei diesem Stamm selbst bei einer sehr hohen Konzentration nicht erreicht werden.

Eine 0,01%ige Konzentration von Zimtöl reichte aus, um das Wachstum aller vier Isolate vollständig zu hemmen. Jasmin- und Lavendelöl verursachten nur eine geringe Wachstumshemmung und konnten das Wachstum nicht vollständig hemmen. Sieben Öle hemmten das Wachstum der C. albicans-Stämme in einem Konzentrationsbereich von 0,03-0,15% vollständig. Bei 11 Ölen reichte die MHK von 0,16% bis 1,0%. Fünf Öle benötigten eine Konzentration von mehr als 1,0% (Tabellen 2 und 3).

3.3 Bestimmung der MFC von Pflanzenölen gegen C. albicans

Die minimale fungizide Konzentration (MFC) ist definiert als die niedrigste Konzentration des Öls, die zum Absterben von 99,9% des Inokulums führt. Alle Öle, die das Wachstum hemmen, zeigten eine fungizide Wirkung, mit Ausnahme von Jasmin- und Lavendelöl. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass die fungizide Konzentration über der MHK lag, mit Ausnahme einiger weniger Öle wie Pfefferminz-, Geranien-, Ocimum-, Nelken- und Ingwergrasöl, die den Tod von 99,9 % des Inokulums bei der MHK verursachten. Anhand ihrer MFC gegen ATCC10231 konnten die wirksamen Öle in drei Klassen eingeteilt werden. Die Öle, die bei einer Konzentration von 0,03-0,15% eine fungizide Wirkung haben, werden als die wirksamsten (ME) angesehen. Öle, die eine Konzentration von 0,15-1,0 % erfordern, gehören zur Gruppe der mäßig wirksamen Öle (MoE). Diejenigen, die bei einer Konzentration von mehr als 1,0 % als fungizid befunden wurden, gelten als weniger wirksam (LE).

Sieben Öle erwiesen sich als am wirksamsten (ME) (Tabellen 2 und 3). Zimtöl war das beste, das in einer Konzentration von 0,03% bei allen vier Isolaten von C. albicans eine fungizide Wirkung zeigte. Nelkenöl wirkte in einer Konzentration von 0,12 % fungizid und es gab keinen Unterschied zwischen MHK und MFC. Bei der Mehrzahl der ME-Öle war das 2-4-fache der MHK für eine fungizide Wirkung erforderlich. Die Reaktion der Candida-Isolate auf einige Mitglieder dieser Gruppe war unterschiedlich, d.h. auf den Stamm CA II im Fall von japanischem Minzöl und Ingwergrasöl, CA III im Fall von Zitronengrasöl und CA IV im Fall von Ingwergrasöl (Tabelle 2).

Pfefferminz- und Teebaumöl waren die besten unter den sieben Mitgliedern der ME-Gruppe und verursachten eine fungizide Wirkung bei einer Konzentration von 0,25% (Tabelle 3). Tulsi-Öl war bei einer Konzentration von 0,5 % fungizid, 1 % war die MFC von Kampfer-, Zitronen-, Ocimum- und Ylang-Ylang-Öl. Für einige Mitglieder dieser Gruppe wurden auch Empfindlichkeitsunterschiede festgestellt. Für diese Öle war das Zweifache der MHK erforderlich, außer für Pfefferminz- und Ocimumöl (Tabelle 2).

Neun Öle erwiesen sich als weniger wirksam (Tabelle 3). Diese Öle benötigten mehr als 1,0 %, um eine fungizide Wirkung auszuüben. Die MFC dieser Öle reichte von 1,0 % bis 3 %, mit Ausnahme von Jasmin-, Ingwer- und Wacholderöl, die bis zu einer Konzentration von 3 % nicht fungizid waren. CA II und CA III zeigten unterschiedliche Empfindlichkeit (Tabellen 2 und 3).

4 Diskussion

Die Anti-Candida-Aktivität einiger ätherischer Öle wie Teebaumöl ist bekannt. Viele der Präparate, die gegen die durch C. albicans verursachte vaginale Candidose eingesetzt werden, enthalten Teebaumöl als aktiven Bestandteil. Mehrere Öle pflanzlichen Ursprungs wurden in der alternativen Medizin gegen mikrobielle Infektionen, einschließlich Candidose und Gingivitis, vorgeschlagen. Dennoch sind Azol-Antimykotika und ihre Derivate nach wie vor das Mittel der Wahl gegen Candida-Infektionen, sei es zur topischen Anwendung oder zur oralen Verabreichung. Mit Ausnahme von Teebaumöl, das in Australien seit mehr als 80 Jahren verwendet wird, sind nur wenige pflanzliche Produkte auf dem Markt. Einige Produkte, die Rosmarinöl enthalten, werden gegen Pilze eingesetzt, die Schuppen verursachen. In vitro wurde über die Anti-Candida-Aktivität von ätherischen Ölen wie Teebaum, Zitronengras, Citronella, Pfefferminze und Palmarosa berichtet. Wir haben die Wirksamkeit von 38 Ölen pflanzlichen Ursprungs auf ihre In-vitro-Anti-Candida-Aktivität gegen vier Isolate von C. albicans untersucht (Tabellen 1 und 2). Mindestens 23 der getesteten Öle erwiesen sich als vielversprechende Wirkstoffe. Diese Öle konnten je nach ihrer Wirksamkeit klassifiziert werden (Tabelle 3). Eines der Isolate, das sich als resistent gegen Fluconazol erwies, wurde durch eine sehr niedrige Konzentration aller in dieser Studie getesteten wirksamen Öle pflanzlichen Ursprungs gehemmt (Tabelle 2).

Der Scheibendiffusionstest ist eine weit verbreitete Standardmethode für das schnelle Screening von Naturprodukten auf antimykotische Aktivität. Wir haben Pflanzenöle mit dieser sehr praktischen Testmethode untersucht. Diese Studie zeigt, dass Vorsicht geboten ist, da verschiedene Öle unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeiten auf Agarplatten aufweisen können, was zu Abweichungen in den Hemmhöfen führen kann, was wiederum zu falschen Schlussfolgerungen hinsichtlich ihrer antimykotischen Aktivität führt. So waren beispielsweise einige der Öle, die im Vergleich zu anderen kleinere Hemmzonen aufwiesen, im NCCLS-Bouillonverdünnungstest, der keine Diffusion beinhaltet, sehr wirksam gegen Candida-Stämme. Zum Beispiel wies Zimtöl im Scheibendiffusionstest einen ZOI von 24 mm auf, während Zitronengrasöl 30 mm zeigte. Im MFC-Test war Zimtöl (0,01 %) jedoch besser als Zitronengrasöl (0,06 %). Fungizide Aktivität wird als eine wünschenswerte Eigenschaft für antimykotische Mittel angesehen, da sie den Pilz vollständig aus dem Gewebe eliminieren kann. Amphotericin B ist fungizid, gilt als sehr wirksam gegen humanpathogene Pilze und wird trotz seiner schweren Nebenwirkungen als Mittel der Wahl bei systemischen Pilzinfektionen eingesetzt. Fluconazol, das weit verbreitete Antimykotikum gegen Candida-Infektionen, ist von Natur aus fungistatisch und kann eine längere Anwendung erfordern.

Es ist ermutigend festzustellen, dass die meisten der in dieser Studie verwendeten Öle bei niedrigen Konzentrationen fungizid waren. Über die Wirkungsweise der natürlichen Produkte, die das Candida-Wachstum hemmen, liegen nicht viele Informationen vor. In künftigen Studien müssen mehr Fluconazol/Azol-resistente Stämme einbezogen werden. Die Pflanzenöle könnten als Anti-Candida-Mittel gegen azolresistente Stämme eingesetzt werden. Die meisten der in dieser Studie verwendeten Öle werden seit langem in Lebensmitteln, Süßwaren und als Bestandteile von Parfüms verwendet. Wenn sie jedoch für topische Zubereitungen in Betracht gezogen werden sollen, muss eine sorgfältige Untersuchung ihrer wahrscheinlichen reizenden und anderen unerwünschten Wirkungen beim Menschen vorgenommen werden.

Danksagung

Die Autoren sind Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) India, für die Ermutigung dankbar.