Die Schleusen des Kanals funktionieren durch die Schwerkraft des Wassers aus den Seen Gatún, Alajuela und Miraflores, die durch den Chagres und andere Flüsse gespeist werden. Die Schleusen selbst haben eine einheitliche Länge, Breite und Tiefe und wurden paarweise gebaut, um die gleichzeitige Durchfahrt von Schiffen in beide Richtungen zu ermöglichen. Jedes Schleusentor hat zwei Flügel, die 20 Meter breit und 2 Meter dick sind und an Scharnieren befestigt sind. Die Tore haben eine Höhe von 14 bis 25 Metern (46 bis 82 Fuß) und werden durch in die Schleusenwände eingelassene Elektromotoren angetrieben. Sie werden von einem Kontrollturm aus bedient, der sich an der Wand befindet, die jedes Schleusenpaar voneinander trennt, und von dem aus auch das Fluten oder Entleeren der Schleusenkammern gesteuert wird. Die Schleusenkammern sind 300 Meter lang, 33 Meter breit und 12 Meter tief.

Aufgrund der empfindlichen Natur der ursprünglichen Schleusenmechanismen ist es nur kleinen Schiffen erlaubt, die Schleusen ohne Hilfe zu durchfahren. Größere Schiffe werden von elektrischen Schlepplokomotiven geführt, die auf Zahnschienen an den Schleusenwänden laufen und dazu dienen, die Schiffe in der Schleuse zu zentrieren. Bevor eine Schleuse betreten werden kann, muss eine zwischen den Wänden der Zufahrt gespannte Fenderkette passiert werden. Wenn alles richtig läuft, wird diese Kette in ihre Rille am Boden des Kanals fallen gelassen. Wenn sich das Schiff zufällig zu schnell bewegt, um sicher zu sein, bleibt die Kette gespannt und das Schiff läuft gegen sie. Die Kette, die durch eine hydraulische Maschine in den Wänden betätigt wird, läuft dann langsam durch automatische Freigabe aus, bis das Schiff zum Stillstand gekommen ist. Sollte sich das Schiff von der Schlepplokomotive lösen und durch die Kette brechen und das erste Tor rammen, schützt ein zweites, 15 Meter entferntes Tor die Schleuse und verhindert ein weiteres Vordringen.

Die dritten Schleusensysteme des 2007 begonnenen Projekts „Third Set of Locks“ wurden von der Berendrecht-Schleuse in Antwerpen, Belgien, und von wassersparenden Becken in Kanälen in Deutschland inspiriert. Für den Bau der Schleusenkammern auf der Atlantik- und der Pazifikseite wurden rund 190 000 Tonnen Stahl, größtenteils aus Mexiko, in stark bewehrtem Beton verankert. Die neuen Schleusentore sind bis zu 10 Meter breit, 30 Meter hoch und 58 Meter lang. Die neuen Kammern und Becken, die das aus dem Gatún-See abfließende Wasser kontrollieren werden, wurden so konzipiert, dass die Turbulenzen des Wasserflusses und die Beeinträchtigung der durchfahrenden Schiffe minimiert werden. Die Becken wurden im Juni 2016 fertiggestellt und umfassen 158 Ventile, die aus 20.000 Tonnen Baumaterial bestehen. Nach Angaben der Behörden sind diese wassersparenden Becken die größten der Welt und ermöglichen eine 60-prozentige Wiederverwendung von Wasser. Während die bestehenden Schleusen bei jeder Benutzung 52 Millionen Gallonen (197 Millionen Liter) verbrauchen, sind es bei den neuen Schleusen 48 Millionen Gallonen (182 Millionen Liter).