Ein unkompetitiver Hemmstoff ist ein Hemmstoff, der nur an den Enzym-Substrat-Komplex bindet. Seine Bindungsstelle bildet sich erst, wenn das Enzym und das Substrat untereinander interagiert haben. Die unkompetitive Hemmung funktioniert nicht, wenn zusätzliche Substrate beteiligt sind. Der Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex bildet kein Produkt
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-> E + P
Unkompetitiver Inhibitor bindet an den Enzym-Substrat-Komplex und hindert das Enzym daran, mit dem Substrat unter Bildung eines Produkts zu reagieren, Als solcher wirkt er gut bei höheren Substrat- und Enzymkonzentrationen, bei denen Substrate an Enzyme gebunden sind; die Bindung führt zu einer Verringerung der Konzentration des an das Enzym gebundenen Substrats, von Km und Vmax und zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität des Enzyms zum Substrat.
E + I -> (durch S) ES + I -> E + P
wobei E das Enzym, I der Inhibitor, ES der Enzym-Substrat-Komplex und P das Produkt ist.
Durch die Bindung des Substrats wird die Struktur des Enzyms verändert und die Bindungsstelle für den Inhibitor verfügbar gemacht. Eine nichtkompetitive Hemmung verringert die maximale Geschwindigkeit und den KM-Wert. K,M ist die Konzentration des Substrats, bei der die Geschwindigkeit die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit beträgt, basierend auf dem Michaelis-Menten-Kinetik-Modell. Sowohl Vmax als auch KM werden um den gleichen Betrag reduziert. Vmax wird immer noch reduziert, obwohl die Enzym-Substrat-Bindung erhöht ist, weil ESI-Komplexe gebildet werden. ESI-Komplexe hemmen die Bildung des Produkts. Ein nicht-kompetitiver Inhibitor senkt den KM-Wert und bewirkt eine bessere Enzym-Substrat-Bindung, da er nur an den ES-Komplex bindet. Der ES-Komplex wird jedoch durch die Bindung des Inhibitors ständig dezimiert, wodurch ESI-Komplexe entstehen. Um das Gleichgewicht zwischen ES- und ESI-Komplexen aufrechtzuerhalten und dem Prinzip von Le Chatelier zu folgen, verlagert sich die Reaktion daher in Richtung einer verstärkten ES-Bildung, bei der mehr Substrat an die Enzyme gebunden wird, so dass mehr ES entstehen. Letztendlich führt dies zu einem niedrigeren KM. Ein niedrigerer KM weist auf eine bessere Enzym-Substrat-Bindung hin, da das Enzym die Hälfte seiner maximalen Geschwindigkeit mit einer geringeren Substratkonzentration erreichen kann. In gewissem Sinne ist die Enzym-Substrat-Bindung sehr effizient, weil Enzym und Substrat eine hohe Affinität haben und stark interagieren.