Abstract

Wir untersuchten die Auswirkungen einer Behandlung mit Vanadylsulfat (VOSO4) in einer Dosierung von 5 und 10 mg/kg über 30 Tage auf die endokrine Aktivität der Bauchspeicheldrüse und die Histologie bei nichtdiabetischen und STZ-induzierten diabetischen Ratten. In der diabetischen Gruppe stieg der Blutzuckerspiegel deutlich an, während die Insulinämie deutlich abnahm. Am Ende der Behandlung normalisierte VOSO4 in einer Dosis von 10 mg/Kg den Blutzuckerspiegel in der diabetischen Gruppe, stellte die Insulinämie wieder her und verbesserte die Insulinsensitivität erheblich. VOSO4 erhöhte auch dosisabhängig die Anzahl der Insulin-immunopositiven Betazellen in den Pankreasinseln von nicht-diabetischen Ratten. Darüber hinaus wurde in der STZ-diabetischen Gruppe der Rückgang der Anzahl der insulinimmunpositiven Betazellen korrigiert, um das Kontrollniveau hauptsächlich mit der höheren Vanadiumdosis zu erreichen. Daher normalisierte die Behandlung mit VOSO4 die Plasmaglukose- und Insulinwerte und verbesserte die Insulinsensitivität bei experimentellem STZ-Diabetes und induzierte die Proliferation und/oder Regeneration von Betazellen bei normalen oder diabetischen Ratten.

1. Einleitung

Vanadium ist ein Übergangsmetall. Es wird geschätzt, dass mehr als 60 Tausend Tonnen dieses Elements jedes Jahr in die Atmosphäre emittiert werden, und zwar als Ergebnis menschlicher Aktivitäten, vor allem durch die Verbrennung fossiler Brennstoffe.

Nach dem Eintritt in den Blutkreislauf über den Magen-Darm-Trakt oder die Atemwege werden Vanadiumverbindungen durch Transferrin oder, seltener, durch Albumin oder niedermolekulare Bestandteile des Plasmas, wie Citrate und in geringerem Maße Laktate oder Phosphate, transportiert. Es wurden zahlreiche Studien mit anorganischen und organischen Vanadiumderivaten an Tiermodellen mit induziertem Diabetes durchgeführt, bei denen sich herausstellte, dass die untersuchten Verbindungen den Glukose-, Cholesterin- und Triglyceridspiegel beeinflussen, ohne dass es bei längerer Verabreichung zu nennenswerten schädlichen Nebenwirkungen kommt. Zahlreiche Experimente wurden auch an Diabetikern durchgeführt, die die therapeutische Wirkung von Vanadiumverbindungen auf den Blutzuckerspiegel mit geringen toxischen Wirkungen bestätigten.

Vanadium (einschließlich Vanadyl und Vanadat) senkt nachweislich den Blutzuckerspiegel durch Stimulierung der Glykogenese, der Glukoseaufnahme und des Stoffwechsels sowie durch Hemmung der Glukosebildung über die hepatische Glukoneogenese und Glykogenolyse. Es wurde festgestellt, dass Vanadium und Vanadiumverbindungen eine insulinähnliche Aktivität aufweisen, indem sie die Insulinwirkung über die Aktivierung der Insulinrezeptor-Tyrosinkinase und die Kinasephosphorylierungskaskade imitieren. Daher wurde Vanadylsulfat als therapeutisches Mittel für die Behandlung von Typ-1-Diabetes vorgeschlagen. Die Behandlung mit Streptozotocin (STZ) zerstört die Beta-Insulin produzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse, und STZ-induzierte diabetische Ratten gelten als Modell für Typ-1-Diabetes mellitus. Obwohl sich gezeigt hat, dass Vanadiumverbindungen im STZ-induzierten Diabetesmodell antidiabetische Eigenschaften haben, wird der Mechanismus ihrer Wirkung derzeit noch untersucht. Ziel dieser Studie war es, die Reaktionen auf eine 30-tägige Behandlung mit Vanadiumsulfat bei nicht-diabetischen und STZ-induzierten diabetischen Ratten zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Vorbereitung der diabetischen Ratten

Die Tiere wurden durch eine intraperitoneale Injektion (ip) von STZ in einer Einzeldosis von 65 mg/Kg in 0,01 M Citratpuffer (pH 4,5) diabetisch gemacht. Diese ip-Methode wurde aufgrund neuerer Berichte gewählt, die einen ausgeprägten glukoseerhöhenden Effekt bei STZ-diabetischen Ratten zeigten.

2.2. Tiere und Behandlung

Männliche Wistar-Ratten, 5-6 Wochen alt (Gewicht 175-200 g), wurden vom Pasteur-Institut in Tunesien erworben und in Übereinstimmung mit der lokalen Ethikkommission der Universität Tunis für die Verwendung und Pflege von Tieren gemäß den Empfehlungen der NIH verwendet. Sie erhielten Futter (Standardpelletfutter – Badr Utique-TN) und Wasser ad libitum und wurden zu fünft pro Käfig bei einer Sammeltemperatur (22°C) und einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus untergebracht. Die Ratten wurden in sechs Gruppen aufgeteilt.

Gruppe 1 waren nicht-diabetische Kontrolltiere (ND-Kontrolle) und erhielten täglich eine intraperitoneale Injektion (ip) von NaCl 9. Die Gruppen 2 und 3 waren ND und erhielten 30 Tage lang täglich eine Dosis von 5 bzw. 10 mg VOSO4/Kg (ND + 5 mg/Kg und ND + 10 mg/Kg). Gruppe 4 war eine diabetische Kontrollgruppe (D-Kontrolle), der eine einmalige Dosis von 65 mg/Kg STZ injiziert wurde. Die Gruppen 5 und 6 umfassten STZ-diabetische Tiere, die 30 Tage lang entweder mit 5 oder 10 mg/Kg VOSO4 behandelt wurden (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Die STZ-Gruppen wurden nach 48 Stunden STZ-induziertem Diabetes mit VOSO4 behandelt.

2.3. Biochemische Assays

Alle Tiere wurden 12 Stunden vor der Bestimmung des Blutzuckerspiegels mit einem Glukometer (ACCU-CHEK-Active Roche) gefastet. Die Insulinsensitivität wurde nach intravenöser Injektion von 1 U/Kg Insulin gemessen, und der Blutzuckerspiegel wurde in 30-minütigen Abständen während 2 Stunden als Prozentsatz des Hormonspiegels bei.

Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Behandlung getötet, und das Blut wurde entnommen und das Serum wurde für die Bestimmung des Insulins aufbereitet, das mit einem Elisa-Kit (vertrieben von BioVendor) bestimmt wurde.

2.4. Immunhistochemische Auswertung

Die immunhistochemische Färbung von Insulin wurde durchgeführt, um die Integrität der Betazellen in den Langerhans-Inseln zu charakterisieren. Hierfür wurden Gewebeschnitte mit der größten Oberfläche der Langerhans-Inseln für den Vergleich zwischen den Gruppen ausgewählt. Die Schnitte wurden zunächst entparaffiniert, durch eine abnehmende Ethanolreihe hydratisiert, 40 Minuten lang in Tamponzitrat (pH 6) getaucht und dann mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Anti-Insulin-Antikörper, verdünnt in 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO), inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem Phosphatase-konjugierten Anti-Meerschweinchen-Antikörper inkubiert, und das Verfahren der Enthüllung wurde durch die TechMate 500 Maschine unterstützt. Abschließend wurden die Schnitte mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.

Zehn Pankreasinseln pro Ratte wurden unter dem Mikroskop untersucht, und die Anzahl der Insulin-positiven und Insulin-negativen Zellen wurde durch Zählen der Zellkerne ermittelt. Die Daten werden als Prozentsatz der Insulin-immunopositiven Zellen/Gesamtzahl der Zellen in jeder Insel ausgedrückt.

2.5. Statistische Analyse

Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen wurde durch eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Tukey-Vergleichstest, bewertet, und der Wert wurde als signifikant auf dem Niveau angesehen.

3. Ergebnisse

Die Wirkung der VOSO4-Behandlung auf die Blutzuckerwerte bei nicht diabetischen (ND) und diabetischen (D) Ratten ist in Abbildung 1 dargestellt. In der ND-Kontrollgruppe traten während der Behandlung keine signifikanten Veränderungen des Blutzuckerspiegels auf (Abbildung 1(a)). Die Behandlung der ND-Ratten mit VOSO4 in einer Dosierung von 5 oder 10 mg/kg veränderte den Blutzuckerspiegel in den ersten 10 Tagen nicht signifikant. Der Blutzuckerspiegel sank jedoch am Ende der Behandlung mit einer Dosis von 5 mg/Kg signifikant ab und war im Zeitraum von 15 bis 30 Tagen mit einer Dosis von 10 mg/Kg im Vergleich zur ND-Kontrollgruppe signifikant reduziert. Am 30. Tag betrug der Rückgang des Blutzuckerspiegels bei den Dosierungen von 5 und 10 mg/Kg im Vergleich zur Kontrollgruppe etwa 8 bzw. 15 %. Wie vermutet, wurde bei den STZ-behandelten Kontrollratten im Vergleich zu den unbehandelten Tieren ein deutlicher Anstieg des Blutzuckerspiegels beobachtet ( versus mg/dL), was auf eine Diabetes-Installation hinweist, die während des gesamten Versuchs aufrechterhalten wurde. Die Behandlung der diabetischen Gruppe (D) mit 5 mg/Kg VOSO4 senkte den Blutzuckerspiegel ab Tag 10 signifikant, während eine Dosis von 10 mg/Kg den Blutzuckerspiegel ab Tag 5 signifikant und allmählich verringerte, bis er am 30. Die festgestellten Blutzuckerwerte nach 30 Tagen betrugen in den Gruppen D + 5, D + 10 und der Kontrollgruppe D jeweils mg/dL (Abbildung 1(b)).

Tabelle 1 zeigt die Insulinspiegel in den Gruppen ND und D ohne und nach Behandlung mit VOSO4. Die ND-Ratten, die mit 5 mg/Kg VOSO4 behandelt wurden, wiesen keine signifikanten Veränderungen des Insulinspiegels auf, aber ein deutlicher Anstieg wurde mit 10 mg/Kg im Vergleich zur ND-Kontrollgruppe erzielt ( versus µg/L). Darüber hinaus war die Insulinämie in der D-Gruppe im Vergleich zu den ND-Tieren stark reduziert (im Vergleich zu µg/L). Die Verabreichung von VOSO4 in den D-Gruppen erhöhte die Insulinämie in einer dosisabhängigen Weise deutlich. Tatsächlich stiegen die Insulinwerte bei diabetischen Ratten von 5 mg auf µg/L bzw. 10 mg/Kg an.

Die Veränderungen der Insulinsensitivität nach einer ip-Injektion von Insulin (1 U/Kg) bei normalen und diabetischen Tieren sind in Abbildung 2 dargestellt. Bei ND-Ratten veränderte die Behandlung mit 10 oder 5 mg VOSO4 das Glykämieprofil als Reaktion auf die Insulingabe nicht (Abbildung 2(a)). Tatsächlich wurde in diesen Gruppen die maximale hypoglykämische Wirkung von Insulin nach 60 bzw. 90 Minuten beobachtet und entsprach in etwa dem anfänglichen Blutzuckerwert. Diabetische Tiere, die mit der niedrigen VOSO4-Dosis behandelt wurden, zeigten ein ähnliches Glykämieprofil wie die D-Kontrollgruppe mit einer maximalen Abnahme nach 60 Minuten, während die mit der hohen Dosis behandelten Tiere eine signifikante () und schnelle maximale Abnahme der Glykämie nach 30 Minuten nach der Insulininjektion aufwiesen (Abbildung 2(b)).

In den mit VOSO4 behandelten Gruppen wurde eine Vergrößerung der Pankreasinseln im Vergleich zu den entsprechenden ND- und D-Kontrollgruppen beobachtet (Abbildungen 3 und 4). Statistische Analysen zeigten, dass die VOSO4-Behandlung einen deutlichen Anstieg der Anzahl der immunopositiven Insulin-Zellen um etwa 20 % in der ND + 5 und 27 % in der ND + 10 mg/Kg-Gruppe bewirkte (Abbildung 5). Die Behandlung mit VOSO4 erhöhte die Anzahl der immunopositiven Insulin-Zellen in den STZ-diabetischen Gruppen dosisabhängig um 12 bzw. 23 % bei einer Dosierung von 5 bzw. 10 mg/Kg (Abb. 5). Der Vergleich zwischen den mit STZ-diabetischen Ratten behandelten Gruppen und den ND-Kontrollratten ergab keine signifikanten Unterschiede.

(a)

(b)

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Abbildung 5

Wirkung von Vanadylsulfat auf die Anzahl der Betazellen in %. Die Werte sind Mittelwerte ± SD. ; versus ND-Kontrolle. ; versus D-Kontrolle. versus D + 5 mg/Kg. 10 Inseln pro Ratte wurden analysiert.

4. Diskussion

Wir untersuchten die antidiabetischen Eigenschaften von Vanadium, indem wir seine Auswirkungen auf den Blutzucker- und Insulinspiegel sowie auf die B-Zellen der endokrinen Bauchspeicheldrüse untersuchten.

Anhand von STZ-induzierten diabetischen Ratten haben wir gezeigt, dass die Behandlung mit Vanadylsulfat (VOSO4) in einer Dosierung von 5 und 10 mg/Kg den mittleren Blutzuckerspiegel am 10. bzw. 5. Tag im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe signifikant reduziert. Am 30. Tag wiesen die diabetischen Ratten, denen die höhere Dosis der Verbindung verabreicht wurde, ähnliche Blutzuckerwerte auf wie die ND-Kontrolltiere. Bei den ND-Ratten führte die Behandlung mit der niedrigeren VOSO4-Dosis jedoch nicht zu einer signifikanten Veränderung des Blutzuckerspiegels, während die höhere Dosis einen geringen und allmählichen Rückgang am 15. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Daten überein, die zeigen, dass die orale Verabreichung von Vanadiumverbindungen bei STZ-induzierten oder genetisch vererbten oder ernährungsbedingten diabetischen Tieren die Hyperglykämie deutlich verbessert. Beim Menschen berichteten Soveid et al. über die Sicherheit und Wirksamkeit einer oralen Vanadylsulfat-Therapie über einen Zeitraum von 30 Monaten bei Typ-1-Diabetikern, indem sie den Insulinbedarf und den Blutzuckerspiegel verringerten.

Unsere Studie zeigte auch, dass die hypoglykämische Wirkung von VOSO4 in der Diabetikergruppe dosisabhängig von einem deutlichen Anstieg des Basalinsulinämie-Spiegels begleitet wurde. Mit einer Dosis von 10 mg normalisierte sich der Insulinspiegel der diabetischen Ratten nahezu. Der Rückgang des Blutzuckerspiegels, der insbesondere bei diabetischen Ratten, die der Vanadium-Verbindung ausgesetzt waren, registriert wurde, könnte mit dem gleichzeitigen Anstieg der Plasma-Insulinkonzentrationen zusammenhängen. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Daten über die Wirksamkeit von Vanadiumverbindungen bei der Verbesserung des diabetischen Zustands überein.

Weiterhin haben wir die Wirkung der Vanadium-Verabreichung auf die Insulinempfindlichkeit bei diabetischen und nicht-diabetischen Ratten untersucht. In den ND-Gruppen zeigten wir eine maximale hypoglykämische Wirkung von Insulin 60-90 Minuten nach der Hormongabe. In den D-Gruppen hingegen verbesserte die Behandlung mit VOSO4 in einer Dosis von 10 mg die Insulinsensitivität mit einer schnelleren und ausgeprägteren Senkung des Blutzuckerspiegels nach der Hormoninjektion, während die Dosis von 5 mg die Glykämiereaktion der D-Ratten nicht signifikant veränderte. Die durch VOSO4 induzierte verbesserte Insulinsensitivität steht im Einklang mit zahlreichen Studien, die darauf hinweisen, dass Vanadium in verschiedenen Geweben als starkes Insulinmimetikum oder Insulintrophikum angesehen werden kann.

Es wurde gezeigt, dass Vanadiumverbindungen durch mehrere Wirkungsweisen gekennzeichnet sind, die zu einer Blutzuckersenkung führen. In vivo- und in vitro-Studien haben gezeigt, dass Vanadylsulfat den Glukosetransport und -stoffwechsel in Skelettmuskeln, Leber und Fettgewebe erhöht. Dank ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Orthophosphatanionen hemmen die organischen Vanadiumderivate die Proteinphosphotyrosinphosphatase. Sie hemmen auch die Aktivität von PTP-1B, einem Enzym, das für die Dephosphorylierung des Insulinrezeptors verantwortlich ist und eine Insulinresistenz verursacht. Ein weiterer Mechanismus zur Senkung des Blutzuckerspiegels durch Vanadiumverbindungen ist die Aktivierung der PKB/Akt-Kinase, die zu einer Steigerung der Glukoseaufnahme durch den GLUT4-Transporter führt. Die Aktivierung von PKB/Akt stimuliert auch die Phosphorylierung von GSK3, was zu einer Stimulierung der Glykogensynthese führt. Andererseits wurde festgestellt, dass die Hemmung der C-jun N-terminalen Kinase die Insulinsensitivität bei experimentellem Diabetes verbessert.

Vanadium erhöht den Glukosetransport und die Oxidation sowie die Aktivität der Insulinrezeptor-Tyrosinkinase und übt über insulinabhängige oder insulinunabhängige biochemische Wege insulinähnliche Wirkungen auf den Glukose- und Lipidstoffwechsel aus.

Es ist bekannt, dass eine STZ-Behandlung die Betazellen der Pankreasinseln zerstört und einen insulinabhängigen Diabetes mellitus auslöst. So zeigten wir in der vorliegenden Studie eine Verringerung der Fläche der Pankreasinseln in Verbindung mit einer deutlichen Abnahme der Anzahl immunreaktiver Betazellen für Insulin in der Diabetikergruppe im Vergleich zu nichtdiabetischen Kontrolltieren. Sowohl in der ND- als auch in der D-Gruppe vergrößerte die Behandlung mit VOSO4 jedoch die Größe der Pankreasinseln im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen. Vor allem aber erhöhte die VOSO4-Behandlung diabetischer Ratten dosisabhängig die Zahl der immunopositiven Betazellen im Vergleich zur unbehandelten Gruppe, was darauf hindeutet, dass VOSO4 die Betazellen in STZ-induzierten diabetischen Ratten erzeugen kann. Tatsächlich unterschied sich die Anzahl der Betazellen in den Inseln der diabetischen Ratten, die mit 5 und 10 mg VOSO4 behandelt wurden, nicht signifikant von der der ND-Gruppe. Dies steht im Einklang mit früheren Untersuchungen über die insulinotrope Eigenschaft dieser Verbindung in der Bauchspeicheldrüse. Interessanterweise erhöhte die Behandlung mit Vanadium auch die Anzahl der Betazellen in den Inseln von nicht-diabetischen Ratten signifikant.

In einem Mausmodell des Pankreas-Segments mit Alloxan-Perfusion berichteten Waguri et al. über Prozesse der Regeneration von Betazellen aus extra-Insel-Vorläuferzellen. In der Tat könnte die Behandlung mit VOSO4 bei STZ-diabetischen Ratten die Proliferation von Betazellen aus endokrinen Zellen im Inselinneren und die Differenzierung aus Vorläuferzellen außerhalb der Insel stimulieren.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass Vanadylsulfat als potenzielles Antidiabetikum nützlich sein könnte. Da die derzeitigen Erkenntnisse jedoch noch begrenzt sind und hauptsächlich auf Tiermodellen beruhen und wenig über die therapeutischen Formulierungen und die Nebenwirkungen von Vanadiumverbindungen bekannt ist, sind weitere Untersuchungen über ihre langfristige Verwendung als konventionelle Therapie für Diabetiker erforderlich.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Dankbarkeit

Diese Arbeit wurde vom tunesischen Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung unterstützt.