Der Zelltod ist von entscheidender Bedeutung für den ordnungsgemäßen Ablauf normaler und pathophysiologischer Prozesse und ist in biologischen Systemen allgegenwärtig.

Programmierte Formen des Zelltods sind verantwortlich für die Bildung morphologischer Muster während der Entwicklung, für die negative Selektion während der Immunität und für das molekulare „Wettrüsten“ zwischen viralen und Wirtsgenen während der Infektion sowie für Gewebeschäden, die durch Umweltstressoren wie Genotoxine entstehen.

Veränderungen in diesen Zelltodwegen können sich als Krankheiten manifestieren, darunter Krebs, degenerative Störungen und das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS). Die Fähigkeit von Tumorzellen, sich dem programmierten Zelltod zu entziehen, ist ein Kennzeichen der meisten Krebsarten.

In den letzten Jahren ist klar geworden, dass die Messung einzelner Merkmale absterbender Zellen, wie Kernfragmentierung oder Membrandurchlässigkeit, nicht ausreicht, um zwischen den verschiedenen Zelltodwegen zu unterscheiden, zu denen Apoptose, autophagischer Zelltod und Nekrose gehören.

Was benötigt wird, ist eine Multiparameter-Bewertung des Zelltods, die die mechanistischen Ereignisse „hinter den Kulissen“ offenbart. Nach den Empfehlungen des Nomenclature Committee on Cell Death 2009 können zelltodbezogene Prozesse (Apoptose, Nekrose, Autophagie) nach morphologischem Erscheinungsbild, enzymologischen Kriterien, funktionellen Aspekten und immunologischen Eigenschaften klassifiziert werden.

Zelltod in verschiedenen Formen

Apoptose

Apoptose bezeichnet ein gengesteuertes Zellselbstmordprogramm. Eine Vielzahl von zellulären Proteinen, darunter Zelloberflächenrezeptoren, Proteasen und mitochondriale Komponenten, regulieren ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Zelltod durch Apoptose. Mutationen in diesen Proteinen können das Gleichgewicht stören und zum unkontrollierten Überleben und zur Vermehrung von Tumorzellen führen. Die Aufdeckung der Apoptose-Mechanismen kann daher zu neuen Strategien führen, um diese Form des Zelltods für therapeutische Zwecke zu nutzen.

Apoptose geht einher mit einer Verringerung des Zellvolumens, Kernkondensation, DNA-Fragmentierung, Plasmamembranblasen und Verschlucken durch Phagozyten. Außerdem geht die Apoptose typischerweise mit einer Permeabilisierung der Mitochondrienmembran einher, gefolgt von einer Aktivierung der Caspase-Kaskade; alternativ können jedoch auch Nicht-Caspase-Proteasen aktiviert werden.

Nekrose

Nekrose wurde in der Vergangenheit als eine passive Form des Zelltods angesehen. Neuere Daten deuten jedoch darauf hin, dass die Nekrose auch eine alternative Form des programmierten Zelltods sein kann, deren Aktivierung wichtige Folgen haben kann, wie z. B. die Auslösung einer Entzündungsreaktion. Nekrose und Apoptose sind morphologisch sehr unterschiedlich. Die Nekrose geht mit einer Zunahme des Zellvolumens, einer Schwellung der Organellen, einer Ruptur der Plasmamembran und einem Verlust des intrazellulären Inhalts einher.

Im Hinblick auf den Unterschied zwischen Apoptose und Nekrose beruhen die verschiedenen Methoden zur Unterscheidung zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod auf charakteristischen Merkmalen, die visualisiert und/oder gemessen werden können, wie Zellgröße, Zellfragmentierung und DNA-Spaltung.

Autophagie

Autophagie ist ein hochgradig regulierter homöostatischer Abbauprozess, bei dem Zellen ihre eigenen Bestandteile über die lysosomale Maschinerie zerstören und wiederverwerten. Dieser Prozess wird mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter die Alzheimer-Krankheit, das Altern, Krebserkrankungen und Morbus Crohn. In einigen Fällen trägt eine erhöhte Autophagie zum Zelltod bei, indem sie mit pro-apoptotischen Signalwegen in Wechselwirkung tritt. Das Verständnis des Zusammenhangs zwischen Autophagie und apoptotischem Zelltod steht im Mittelpunkt zahlreicher Forschungsarbeiten, insbesondere in der Tumorbiologie.

Autophagie vs. Apoptose

Autophagischer Zelltod ist morphologisch definiert als Zelltod, der ohne Chromatinkondensation auftritt, aber von einer massiven Vakuolisierung des Zytoplasmas begleitet wird. Im Gegensatz zur Apoptose hat die Autophagie wenig oder keine Verbindung zu Phagozyten. Bei dieser Form des Zelltods wird das zytoplasmatische Material in Autophagosomen sequestriert, um von Lysosomen abgebaut zu werden.

Es ist inzwischen bekannt, dass es eine Wechselwirkung zwischen dem apoptotischen und dem Autophagie-Weg gibt, und Studien haben gezeigt, dass BCL2, das ein wichtiger Regulator der Apoptose ist, auch ein wichtiger Regulator des Autophagie-Wegs ist.

Jüngste Fortschritte in der chemischen Biologie, in der Pathway-Analyse und in der hochentwickelten Zytometrie haben tiefere Einblicke in die molekularen Marker und zellulären Veränderungen ermöglicht, die jeden Zelltod-Weg kennzeichnen. Darüber hinaus hat die technologische Entwicklung es möglich gemacht, viele dieser Bewertungen als Routineexperimente auf dem Prüfstand und in Verbindung mit nachgeschalteten Analysen durchzuführen. Zusammengenommen haben diese Fortschritte die Erforschung des Zelltods in die Zerlegung nuancierter Signalnetzwerke verwandelt, die in komplexe Systeme integriert sind.

Eines der zentralen Merkmale des Zelltods, das die wissenschaftliche Gemeinschaft zu untersuchen versucht, ist der Punkt, an dem es kein Zurück mehr gibt, entlang dieser nuancierten Pfade. Es gibt sowohl reversible als auch irreversible Punkte entlang jedes Zelltod-Signalweges, und die Bestimmung des Übergangspunktes in verschiedenen Kontexten ist von großer Bedeutung, wenn man versucht, in den Prozess einzugreifen. Unabhängig von der Art des Zelltods kann der Tod nicht mehr verhindert werden, sobald die Zelle den „Point of no return“ überschritten hat.

Analyse des Zelltods

Um die verschiedenen Formen des Zelltods zu analysieren, zu charakterisieren und zu unterscheiden, sind zwei Arten von Kriterien erforderlich: deskriptive (z. B. Bildgebung) und funktionelle (z. B. Hemmung von Signalwegen). So können beispielsweise die DNA-Fragmentierung und die Caspase-Aktivierung jeweils dazu beitragen, Apoptose zu definieren, aber diese Analysen sind nicht endgültig, wenn sie isoliert verwendet werden, da Apoptose auch ohne DNA-Fragmentierung auftreten kann und die Caspase-Aktivierung auch mit anderen biologischen Prozessen verbunden ist.

Daher sollte der Zelltod immer mit mehreren Methoden gemessen werden, vorzugsweise in derselben Probe, wobei biochemische und morphologische Assays nach Möglichkeit kombiniert werden sollten. Eine Reihe von Technologien kann wertvolle Informationen über die verschiedenen Zelltodwege liefern, darunter Bildgebung, TUNEL, immunologische Assays, Durchflusszytometrie, bildgebende Zytometrie und Technologien für die Bildgebung adhärenter Zellen. Die derzeitigen Methoden zur Untersuchung des Zelltods weisen jedoch einige allgemeine, inhärente Nachteile auf, die ihren Nutzen einschränken können.

Zum Beispiel sind Technologien wie Western Blotting und ELISA nicht in der Lage, spezifische Veränderungen pro Zelle zu ermitteln, obwohl sie sehr nützlich sind, um Informationen über die Gesamtveränderung des Prozesses zu sammeln. Bestimmte bildgebende Verfahren können Einschränkungen dahingehend aufweisen, ob eine äquivalente Anzahl von Zellen von Probe zu Probe gezählt wird oder ob genügend Zellen gezählt werden, was sich auf die Reproduzierbarkeit und/oder Genauigkeit der Ergebnisse auswirken könnte.

Auf der anderen Seite können Methoden wie die multiparametrische Durchflusszytometrie oder die bildgebende Zytometrie sehr leistungsfähig sein und inhaltsreiche Daten für die Analyse des Zelltods liefern, aber diese Methoden können auch Einschränkungen haben. Zum Beispiel kann der Zugang zu Instrumenten begrenzt sein, es kann ein hohes Maß an Fachwissen und Ausbildung erforderlich sein, und die Erschwinglichkeit kann eine Herausforderung darstellen.

In der Industrie besteht ein Bedarf an benutzerfreundlichen, erschwinglichen und leicht zugänglichen Methoden, die robuste, genaue und reproduzierbare Antworten auf alltägliche Fragen geben können, die Forscher im Bereich Zellgesundheit und Zelltod untersuchen. Im Folgenden werden etablierte und neue Methoden zur effektiven Unterscheidung zwischen Apoptose, Nekrose und Autophagie beschrieben.

Bildgebung

Der Zelltod ist letztlich ein morphologischer Prozess und der Goldstandard für die Analyse dieses Prozesses ist die Visualisierung der Zellen. Wenn man den Zelltod in der Kultur beobachtet, ist es sehr offensichtlich, was passiert. Bei der Apoptose beispielsweise runden sich die Zellen ab und scheinen zu kochen (‚blebbing‘). Es gibt verschiedene Ansätze zur Darstellung des Zelltods, darunter die einfache Visualisierung der Zellen in Echtzeit in der Kultur, die Anfärbung von Zellen mit Acridinorange (einem für apoptotische Zellen spezifischen Vitalfarbstoff), die histologische Anfärbung von fixiertem Gewebe und die Elektronenmikroskopie. Auch in der Bildzytometrie gibt es neue Möglichkeiten, wie weiter unten beschrieben.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

Das Verfahren des Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) ist eine sehr verbreitete Methode zur Untersuchung der DNA-Fragmentierung, die durch Apoptose entsteht. TUNEL markiert die terminalen Enden der DNA, die in der Spacer-Region zwischen den Nukleosomen im Chromatin abgespalten werden, und diese DNA-Strangbrüche werden durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht. Obwohl TUNEL ein sehr effektiver Test für Apoptose ist, besteht eine wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes darin, dass TUNEL apoptotische Zellen im letzten Stadium des Prozesses erkennt.

Caspase-Aktivierung

Auf molekularer Ebene ist eine Reihe von Enzymen, die als Caspasen bekannt sind, weitgehend für die Ausführung des apoptotischen, aber nicht des nekrotischen Zelltods verantwortlich. Als Reaktion auf pro-apoptotische Signale nehmen Caspasen an einer Reihe von Reaktionen teil, die zur Spaltung von Proteinsubstraten führen, wodurch die Zelle zerlegt wird. Caspasen kommen in jeder Zelle des Körpers als ruhende Proenzyme vor. Während der Apoptose bilden Caspasen aktive enzymatische Tetramer-Moleküle, die ihre Substrate aktivieren oder inaktivieren können.

Diese Enzyme erkennen spezifisch eine Vier- oder Fünf-Aminosäuresequenz auf dem Zielsubstrat, die einen Asparaginsäurerest als Ziel für die Spaltung enthält. Caspasen spielen auch bei anderen biologischen Prozessen wie der Immunität eine Rolle; viele virale Genome kodieren für direkte Inhibitoren dieser Caspasen. Caspasen können durch Immunpräzipitation oder Immunblotting mit Caspasen-spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden, oder durch die Verwendung von Fluorochrom-Substraten, die bei der Spaltung durch die Caspase fluoreszierend werden. Darüber hinaus kann die Beteiligung von Caspasen durch die Behandlung lebender Kulturen mit Smac-Mimetikum, einem sehr wirksamen Auslöser der Apoptose, sichtbar gemacht werden.

Nachweis von Mitochondrien

Mitochondrien sind wichtige Regulatoren von Zelltodprozessen wie der Apoptose. Der Verlust des inneren Transmembranpotenzials der Mitochondrien wird häufig, aber nicht immer, in Verbindung mit den frühen Stadien der Apoptose beobachtet und es wird angenommen, dass er eine Rolle beim Caspase-unabhängigen Zelltod spielt. Fluoreszenz-basierte Assays zur Bewertung des Funktionsstatus von Mitochondrien sind nützliche Instrumente zur Untersuchung der Rolle der mitochondrialen Aktivität in der Apoptosekaskade.

Phosphatidylserin und Annexin V

Phosphatidylserin (PS), das auf das innere Membranblatt lebensfähiger Zellen beschränkt ist, transloziert in den frühen Stadien der Apoptose auf die freiliegende Membranoberfläche. Dieses Ereignis dient als Signal für phagozytische Zellen zum Angriff. PS wird hauptsächlich an den Oberflächenbläschen apoptotischer Zellen freigesetzt. Annexin V hat eine hohe Affinität für Membranen, die das negativ geladene PS enthalten. Diese Vorgänge können mit Hilfe der Durchflusszytometrie sichtbar gemacht werden.

Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrische Tests für Apoptose sind nun fast 25 Jahre alt. Die ersten Durchflusszytometrie-Assays für Apoptose analysierten Veränderungen der Vorwärts- und Seitenstreuung und der DNA-Fragmentierung nach einer Ethanol-Behandlung. Durchflusszytometrie-Assays zielen nun auf fast jedes Stadium der Apoptose ab, von den frühesten mitochondrialen Veränderungen bis hin zur Caspase-Aktivierung, Membranveränderungen und DNA-Schäden. Im Gegensatz zu früheren Assays analysiert die Durchflusszytometrie die Apoptose in einzelnen Zellen.

Die multiparametrische Durchflusszytometrie ist ein idealer Ansatz für die Kombination mehrerer Zelltod-Assays. FLICA-Caspase-Nachweis, Annexin V und ein zellimpermanenter DNA-bindender Farbstoff (z. B. Propidiumiodid) können zu einem leistungsstarken, mehrstufigen Apoptose-Assay kombiniert werden (Abbildung 1).

Die Kombination dieser Assays ermöglicht die Analyse des Fortschreitens der Apoptose und liefert ein viel umfassenderes Bild, als es ein Assay allein liefern kann.

Eine Tischplattform für die Durchflusszytometrie kann auch sofort quantitative zelluläre Informationen für viele Analysen in den Bereichen Zellgesundheit, Zelltod, Zellsignalisierung, Immunologie und Zellzyklus liefern. Ein solches Gerät nutzt die Prinzipien der Mikrokapillarzytometrie, die die Analyse kleiner Probenmengen ermöglicht. Es handelt sich um eine geschlossene Plattform, bei der die Reagenzien und die Software für spezielle Anwendungen eng miteinander verbunden sind, um den Prozess zu vereinfachen und die analytische Komplexität bei der Durchführung und Gewinnung zytometriebasierter Daten zu verringern.

Die Technologie ermöglicht die gleichzeitige Analyse von zwei Markern und kann zur Durchführung von Zeitverlaufs- und Dosis-Wirkungs-Studien verwendet werden, wodurch tiefere Einblicke in die beteiligten Mechanismen sowie ein umfassenderes Bild des Zelltodprozesses gewonnen werden (Abbildung 2).

Bislang gibt es nur einen einzigen durchflusszytometrischen Assay zur Analyse der Autophagie, der die Messung der leichten Kette 3 (LC3) umfasst. LC3 ist ein Protein, das sich in Autophagosomen ablagert, die defekte Mitochondrien und andere intrazelluläre Organellen phagozytieren, und schließlich in Lysosomen. Autophagie kann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP)-LC3-Translokation nachgewiesen werden (Abbildung 3).

In diesem Assay wird eine Zelllinie stabil mit GFP-LC3 transfiziert. Während der Induktion wird ein Lysozym-Inhibitor hinzugefügt, um die Zerstörung von Autophagosomen durch Lysosomen zu blockieren. Wenn Autophagie auftritt, sammelt sich GFP-LC3 in den Autophagosomen an, wenn der Inhibitor vorhanden ist, und wird nicht in die Medien freigesetzt. Findet keine Autophagie statt, sammelt sich GFP-LC3 im Zytoplasma an und wird in die Medien freigesetzt. Autophagosom-assoziiertes GFP-LC3 kann in den intakten Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.

Bildzytometrie

Die Bildzytometrie ermöglicht die gleichzeitige Erfassung zytometrischer Daten und korrelierter Zellbilder, und es gibt inzwischen viele Optionen für diese Art von Analysen. Da die Apoptose sehr variabel und pleiotrop ist, kann die Bildgebung den Nachweis erbringen, dass Apoptose stattfindet, und den Prozess durch die Visualisierung der Chromatinkondensation und des Zusammenbruchs des Zytoskeletts bis zu einem gewissen Grad charakterisieren. Die Bildzytometrie bietet auch zusätzliche Analysemöglichkeiten, einschließlich der Pixel-für-Pixel-Analyse, die für die Apoptose-Analyse nützlich sind. Darüber hinaus ist eine Ablösung mit Trypsin oder Accutase®, die apoptotische Markierungen „verschmutzen“ kann, nicht erforderlich.

Die Bildzytometrie ermöglicht auch die Analyse von adhärenten Zellen, ohne dass die Zellen von ihrem Substrat entfernt werden müssen. Aus diesem Grund nutzen viele Labors die Bildzytometrie für die Analyse von adhärenten apoptotischen Zellen. Adhärente Zellen, die von ihrem Substrat abgelöst werden, entweder durch Ausschaben oder durch Trypsin, können den apoptotischen Phänotyp stören oder sogar den apoptotischen Prozess selbst auslösen. Die Bildzytometrie ermöglicht es, dass adhärente Zellen während der gesamten Analyse adhärent bleiben, indem die Zellen direkt auf dem Kammerträger gefärbt werden. Es ist zu beachten, dass sich adhärente Zellen abrunden, sobald sie apoptotisch werden, so dass einige der Zellen, die sich in den späteren Stadien der Apoptose befinden, verloren gehen können.

Ein strömungsbasiertes Bildzytometriesystem bietet ebenfalls eine direkte Korrelation zwischen Zytometrie und Bildgebung und kombiniert somit zytometrische und morphologische Analysen. Bei einem strombasierten Bildgebungssystem werden die Zellen nicht auf einem Objektträger abgebildet, sondern direkt im Strom. Wenn Zytometrie und Bildgebung korreliert werden, können lebensfähige, frühe, mittlere und späte apoptotische Zellen gated und analysiert werden (Abbildung 4).

Abschluss – Zelltod: Unterscheidung zwischen Apoptose, Nekrose & Autophagie

Der Zelltod ist ein natürlicher Prozess, der für viele normale physiologische Funktionen sowohl in der Entwicklung als auch in der Homöostase unerlässlich ist. Darüber hinaus werden Veränderungen in den Signalwegen des Zelltods mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die Messung einzelner Merkmale absterbender Zellen reicht nicht aus, um zwischen den verschiedenen Zelltodwegen zu unterscheiden, zu denen Apoptose, Nekrose und Autophagie gehören; stattdessen ist eine Multiparameterbewertung erforderlich, die sowohl beschreibende als auch funktionelle Kriterien umfasst.

Jüngste technologische Fortschritte ermöglichen jetzt tiefere Einblicke in die molekularen Marker und zellulären Veränderungen, die jeden Zelltodweg charakterisieren, und haben es auch möglich gemacht, viele dieser Analysen als Routineexperimente im Labor durchzuführen. DDW

–

Dieser Artikel erschien ursprünglich in der DDW-Ausgabe Winter 2014

–

Dr. John Abrams ist Professor für Zellbiologie; seine Forschung untersucht die molekularen Netzwerke, die in vivo an der Regulierung des Zelltods beteiligt sind, und erforscht die Determinanten der Chromatinorganisation. Er kam 1994 an das University of Texas Southwestern Medical Center und wurde 2004 Programmleiter des Graduiertenprogramms für Genetik und Entwicklung. Dr. Abrams hat an der Stanford University promoviert.

Dr. William G. Telford wurde 1999 Mitarbeiter des National Cancer Institute in den National Institutes of Health und ist Direktor des Kernlabors für Durchflusszytometrie in der Abteilung für experimentelle Transplantation und Immunologie des NCI. Er promovierte in Mikrobiologie an der Michigan State University und absolvierte eine postdoktorale Ausbildung in Immunologie an der University of Michigan Medical School.

Louise Rollins ist Produktmanagerin bei der EMD Millipore Corporation, wo sie die Entwicklung des Muse® Cell Analyzer, eines miniaturisierten Durchflusszytometers, und seiner anwendungsspezifischen Assay-Kits und Softwaremodule für die Routineanalyse von Zellgesundheit und Zelltod unterstützt.