Den protestantiska reformationen var en religiös rörelse som inträffade i Västeuropa under 1500-talet och som resulterade i en splittring av kristendomen mellan romerska katoliker och protestanter. Denna rörelse ”skapade en nord-sydlig splittring i Europa, där i allmänhet de nordliga länderna blev protestantiska medan de sydliga länderna förblev katolska.”
Reformationen gav upphov till två huvudgrenar av protestantismen; den ena var de evangelisk-lutherska kyrkorna, som följde Martin Luthers läror, och den andra var de reformerta kyrkorna, som följde John Calvins och Huldrych Zwinglis idéer. Ur dessa grenar växte tre huvudsekter fram, den lutherska traditionen samt de kontinentala reformerta och anglikanska traditionerna, varav de två sistnämnda följer den reformerta (kalvinistiska) tron. Lutheraner och reformerta kristna hade olika syn på religiösa bilder.
Martin Luther i Tyskland tillät och uppmuntrade visning av ett begränsat antal religiösa bilder i kyrkorna, eftersom han såg den evangelisk-lutherska kyrkan som en fortsättning på den ”gamla, apostoliska kyrkan”. Användningen av bilder var en av de frågor där Luther starkt motsatte sig den mer radikala Andreas Karlstadt. Under några år tillverkades i Tyskland lutherska altarbilder som Sista nattvarden av den yngre Cranach, särskilt av Luthers vän Lucas Cranach, för att ersätta katolska altarbilder, som ofta innehöll porträtt av ledande reformatorer som apostlar eller andra huvudpersoner, men som behöll den traditionella avbildningen av Jesus. På så sätt ”blev den lutherska gudstjänsten en komplex rituell koreografi som utspelade sig i ett rikt möblerat kyrkorum”. Lutheraner fortsatte att använda krucifixet eftersom det framhävde deras höga syn på korsets teologi. Berättelser växte fram om ”oförstörbara” bilder av Luther, som hade överlevt bränder genom gudomligt ingripande. För lutheraner ”förnyade reformationen den religiösa bilden snarare än att ta bort den.”
Å andra sidan fanns det en våg av ikonoklasm, eller förstörelse av religiösa bilder. Detta började mycket tidigt under reformationen, när studenter i Erfurt förstörde ett träaltare i franciskanernas kloster i december 1521. Senare visade den reformerta kristendomen en konsekvent fientlighet mot religiösa bilder, som avgudadyrkan, särskilt skulpturer och stora målningar. Bokillustrationer och trycksaker var mer acceptabla, eftersom de var mindre och mer privata. De reformerta ledarna, särskilt Huldrych Zwingli och Johannes Calvin, eliminerade aktivt bilder från kyrkor som stod under deras anhängares kontroll, och betraktade den stora majoriteten av religiösa bilder som avgudadyrkan. Tidiga kalvinister var till och med misstänksamma mot porträtt av präster; Christopher Hales (som snart skulle bli en av de mariala landsflyktingarna) försökte få porträtt av sex gudsmän skickade till sig från Zürich, och ansåg det nödvändigt att förklara sina motiv i ett brev från 1550: ”De önskas av de skäl som jag har nämnt, och inte av heders- eller vördnadsskäl.”
Destruktionen var ofta extremt splittrande och traumatisk inom samhällen, en omisskännlig fysisk manifestation, ofta påtvingad uppifrån, som inte kunde ignoreras. Det var just därför som reformatorerna föredrog en enda dramatisk kupp, och många förhastade handlingar i denna riktning ökade skarpt den efterföljande fientligheten mellan katoliker och kalvinister i samhällen – för det var i allmänhet på stads-, tätorts- eller bynivå som sådana handlingar ägde rum, med undantag för England och Skottland.
Men reformatorerna kände sig ofta drivna av starka personliga övertygelser, vilket framgår av fallet Frau Göldli, som Zwingli ombads ge råd om. Hon var en schweizisk kvinna som en gång hade lovat den helige Apollinaris att om hon återhämtade sig från en sjukdom skulle hon donera en bild av helgonet till ett lokalt kloster, vilket hon också gjorde. Senare blev hon protestant, och eftersom hon kände att hon måste upphäva vad hon nu såg som en felaktig handling, gick hon till klosterkyrkan, tog bort statyn och brände den. Hon åtalades för hädelse och betalade ett litet bötesbelopp utan att klaga, men vägrade helt och hållet att betala den extra summa som domstolen beordrade att hon skulle betala till klostret för att ersätta statyn, vilket innebar att hon riskerade allvarliga påföljder. Zwingli rekommenderade i sitt brev att försöka betala nunnorna en större summa på villkor att de inte ersatte statyn, men det slutliga resultatet är okänt. I slutet av sitt liv, efter att ikonoklastiska maktdemonstrationer blivit ett inslag i de tidiga faserna av de franska religionskrigen, blev till och med Calvin orolig och kritiserade dem, då han insåg att de hade blivit kontraproduktiva.
Subjekt som är framträdande i katolsk konst förutom Jesus och händelser i Bibeln, till exempel Maria och helgon, fick mycket mindre betoning eller ogillades i protestantisk teologi. Som ett resultat av detta slutade kyrkan i stora delar av norra Europa praktiskt taget att beställa figurativ konst och lade diktatet om innehållet helt och hållet i händerna på konstnärerna och de lekmannamässiga konsumenterna. Kalvinismen motsatte sig till och med icke-religiös begravningskonst, såsom den heraldik och de avbildningar som renässansens rika människor älskade. När det fanns religiös konst blev ikoniska bilder av Kristus och scener från lidandet mindre vanliga, liksom porträtt av helgon och präster. Man föredrog berättande scener från Bibeln, särskilt i form av bokillustrationer och tryck, och senare moralistiska skildringar av det moderna livet. Båda Cranachs målade allegoriska scener med lutherska läror, särskilt en serie om lag och evangelium. Daniel Hisgen, en tysk rokokomålare från 1700-talet i Oberhessen, specialiserade sig på cykler av bibliska målningar som dekorerade framsidan av galleribräcket i lutherska kyrkor med ett övre galleri, en mindre framträdande position som tillfredsställde lutherska skrupler. Orgelskåp av trä målades också ofta med liknande scener som i katolska kyrkor.
Lutheraner försvarade starkt sin befintliga heliga konst mot en ny våg av ikonoklasm mellan kalvinister och lutheraner under andra halvan av århundradet, då kalvinistiska härskare eller stadsmyndigheter försökte påtvinga de lutherska befolkningarna sin vilja under den ”andra reformationen” omkring 1560-1619. Mot de reformerta utropade lutheraner: ”Du svarta kalvinist, du ger tillstånd att krossa våra bilder och hugga våra kors; vi kommer att krossa dig och dina kalvinistiska präster i gengäld”. Beeldenstorm, en stor och mycket oordnad våg av kalvinistisk pöbelförstöring av katolska bilder och kyrkliga inventarier som spred sig i de låga länderna sommaren 1566, var det största utbrottet av detta slag, med drastiska politiska återverkningar. Denna kampanj av kalvinistisk ikonoklasm ”framkallade reaktiva upplopp av lutherska mobbar” i Tyskland och ”retade upp de angränsande östortodoxa” i Baltikum. Liknande mönster som de tyska aktionerna, men med tillägg av uppmuntran och ibland finansiering från den nationella regeringen, sågs i det anglikanska England under det engelska inbördeskriget och det engelska samväldet under det följande århundradet, då mer skada gjordes på konsten i de medeltida församlingskyrkorna än under den engelska reformationen.
En stor teologisk skillnad mellan protestantismen och katolicismen är frågan om transsubstantiation, eller den bokstavliga förvandlingen av nattvardsoblaten och vinet till Kristi kropp och blod, även om både lutheraner och reformerta kristna bekräftade Kristi reella närvaro i eukaristin, de förstnämnda som en sakramental förening och de senare som en pneumatisk närvaro. Protestantiska kyrkor som inte deltog i ikonoklasmen valde ofta som altarbilder scener som föreställer den sista nattvarden. Detta hjälpte gudstjänstbesökarna att påminna sig om teologin bakom eukaristin, till skillnad från katolska kyrkor som ofta valde korsfästelsescener till sina altartavlor för att påminna gudstjänstbesökarna om att Kristi offer och mässans offer var en och samma sak, via den bokstavliga förvandlingen av eukaristin.
Den protestantiska reformationen drog också nytta av trycksakernas popularitet i norra Europa. Trycktekniken gjorde det möjligt att massproducera bilder och göra dem allmänt tillgängliga för allmänheten till en låg kostnad. Detta möjliggjorde en utbredd tillgång till visuellt övertygande bilder. Den protestantiska kyrkan kunde därför, precis som den katolska kyrkan hade gjort sedan början av 1400-talet, föra ut sin teologi till folket, och den religiösa undervisningen fördes från kyrkan in i det vanliga folkets hem och bildade på så sätt en direkt koppling mellan troende och det gudomliga.
Det pågick också ett våldsamt propagandakrig som delvis utkämpades med hjälp av populära trycksaker från båda sidor; dessa var ofta mycket skällsordiga karikatyrer av den andra sidan och deras doktriner. På den protestantiska sidan var porträtt av de ledande reformatorerna populära, och deras avbildningar föreställde ibland apostlarna och andra figurer i bibliska scener som den sista måltiden.