Abstract
リハビリテーション治療において、痛みのレベルを理解し、正確に評価することは重要な要素である。 痛みは個人の感情や健康状態に影響される複雑かつ主観的な体験である。 これまで，痛みの定量的評価のために様々な方法が開発されてきたが，これらの方法にはいくつかの欠点がある。 そこで本研究では，痛みの定量的な評価のための痛み測定装置を開発した。 本装置は、電気刺激用部品と圧力計の2つの部品からなり、2つの異なるストレスを加えることができる。 電気刺激については，印加電流により痛みの程度を評価する。 また、皮膚の状態による影響を取り除くために、電流を流して皮膚抵抗を分析した。 電気刺激によって、組織に組織学的な変化や炎症は誘発されなかった。 圧力ドロリメーターを用いて、炎症の度合いに応じて痛みの程度を評価した。 このシステムは、炎症や傷などによって引き起こされる痛みの定量的な評価に利用できると考えられる。 本システムは初めての試みであるため、解決しなければならない問題が多く残されています。 しかし、今後も開発を続けることで、皮膚状態の影響を除去し、クロスバリデーションにより、より正確な痛み評価が可能になると考えられる。 はじめに
リハビリテーションにおいて，患者の痛みの尺度を評価することは重要な課題である。 しかし、痛みは個人の特性や経験に関連した複雑な感覚であるため、測定は困難である。 これまでにもVisual Analog Scale（VAS），数値評価尺度（NRS），言語評価尺度（VRS），FACES Pain Rating Scale（FPRS），McGill Pain Questionnaire（MPQ）など様々な疼痛評価方法が開発されてきた。 このうち、VASとFPRSは主に臨床の場で使用されてきた。 VASは10cmという一定の長さの直線として設計されている。 両端は測定するパラメータの極限として定義され，”痛みなし “から “想像しうる最悪の痛み “までの方向が設定されている。 患者は、現在経験している痛みの強さに対応する線上に印をつける。 NRSは、患者に現在の痛みの強さを最もよく表す0から10までの数字を選ぶように指示する。 0は “痛みなし”、10は “起こりうる最悪の痛み “を意味する。 VRSは、数字の代わりに言葉で表現する痛みの評価法である。 患者さんは、痛みの感覚を表すために、無痛、中程度の痛み、激痛、非常に激しい痛み、最悪の痛みなどの文章を選択します。 FPRSは、痛みのレベルの上昇を6つの顔で表現する6段階疼痛尺度です。 患者さんには、”痛みなし “から “激しい痛み “まで、痛みの強さを最もよく表す表情を選んでもらいます。 これらの方法はいずれも主観的であり、個人の経験や感情に依存する。
近年、電気刺激を用いた定量的な痛みの評価方法が紹介された。 PainVision™は、電流を流すことで知覚閾値と痛みを測定する装置である。 このシステムは、経験した痛みと電気的な知覚の強さを比較することで、痛みの強さを定量的に評価する。 知覚閾値は個人が感じる最小の電流を示し、発生する痛みは個人が感じる最大の電流と定義される。 しかし、個人の皮膚抵抗が電気的な測定結果に影響を与える可能性がある。 ペインビジョンは、皮膚抵抗に関係なく測定ができるシステムである。 皮膚抵抗は、患者の状態や環境によって変化する。 皮膚抵抗を無視して痛みを測定した場合、過去の測定値との相関を説明することは困難である。
患者さんの皮膚抵抗の基準値を決めてから、痛みを測定します。 つまり、皮膚抵抗値が基準となるのです。 基準値を用意すると、痛み測定前後に測定した痛み値の相関の記述が可能になる。
本研究では、より正確なクロスバリデーション評価を行うために、電気刺激と圧力を加えるという2つの解析方法を持つ痛み測定装置を開発した。 電気刺激では、痛みのない部位に電気的ストレスを与え、その後、観察されたストレスを痛みと比較することができる。 電気刺激を受けた組織は組織学的に検査され、電気刺激による組織損傷の有無が確認された。 圧痛評価では、疼痛部位に圧を加えて痛みを評価した。 ラットの後肢にカラギーナンで炎症を起こさせ、炎症を起こした後肢をハンドタイプの圧力刺激装置で刺激した。 2.材料と方法
2.1. 痛み測定装置の原理と構成要素
痛み測定装置は、痛みの定量的な解析を目的として開発された。 この装置は図1に示すように電気刺激用部品と圧力計の大きく2つの部品から構成されている。 刺激は電気的または圧力によって個々人に別々に加えることができる。 電気刺激と圧力による反応を比較することで、より正確な結果を得ることができるようになった。 電気刺激では、患者が経験した痛みを電気刺激に置き換える。すなわち、印加した電流値を経験した、あるいは体験した痛みの値に変換する。 また、電気刺激と皮膚抵抗を同時に評価することで、皮膚や身体の変化、天候や環境などの条件が変わっても、客観的に痛みを評価することが期待できる。 圧痛計を使用しながら、痛みのある部位に直接圧力をかけ、その圧力量によって痛みの発現を測定する
痛み測定装置には、電源、ES（電気刺激）、PS（圧力刺激）、EB（緊急ボタン）、SS（ストップスイッチ）の5つのボタンが利用されています。 ESとPSは、個人に電気刺激と圧力刺激を与えるために利用される。 EBは緊急時に利用できる電源停止ボタン、SSは痛み測定の終了時に利用するボタンである。 電気刺激コンポーネントには、知覚電流（50Hz、パルス幅0.3ms）と痛覚閾値を測定するための2つの電極が接続されています。 2つの電極は、動物の脇腹や人間の前腕内側など、平らな部位に設置される。 電気刺激方式は、痛みと同じレベルの刺激と刺激強度を与え、Ad-fiberは主に痛みの信号（電気信号）を伝導する。 圧力ドロリメーターは、ハンド刺激装置のチップ型圧力センサーに接続されている。 参加者が痛みを感じると停止スイッチが押される
2.2. 動物モデルの準備
体重250-350g、49-56日齢のSprague-Dawley成体雄ラット（Raon Bio. Inc., Yongin, Korea）を中央動物飼育施設において12時間明暗サイクル（06：00に点灯）で24±0.5℃にて飼育した。 実験開始まで水とラット用飼料をアドリビで供給した。 すべての動物実験は、慶熙大学医学部動物実験委員会の承認を受け（KHUASP(SE)-15-084）、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに厳密に準拠して扱われた
2.3. Histological Examination
ラットに電気刺激を与えるか、カラギーナンを投与して痛みを誘発させた。 2つの異なる処理によって誘発された炎症反応を、組織学的評価によって比較した。 ラットはヘパリン（0.2 U/ml）と4%パラホルムアルデヒドを含む冷PBSで心内灌流した後、4%パラホルムアルデヒド中にストックした。 電気刺激およびカラギーナン刺激により生じたストレス組織を二等分し、包埋カセットに入れた。 各サンプルをパラフィンワックスに包埋し、回転式ミクロトーム（HM340E, Microm, Walldorf, Germany）を用いて5μm厚のサンプルに切片化した。 切片化した試料をヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色した後、Nis-Elements（Br）ソフトウェア（株式会社ニコン、日本、川崎）で制御したニコン倒立研究顕微鏡Ti-EとニコンDs-Ri1デジタルカメラで分析した
2.4. 免疫蛍光染色
電気刺激が組織の炎症とアポトーシスに及ぼす影響を免疫蛍光染色で調べた。 ラットの電気刺激を受けた脇腹の組織をパラフィンに包埋し、厚さ4μmに切片化した。 抗原賦活のため、組織切片をTRSバッファーで約10分間加熱し、蒸留水を用いて3回洗浄した。 内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために0.03％H2O2で処理し、PBS溶液で洗浄した。 次に、サンプルをPBS中の0.5% Triton X-100で室温で10分間透過処理し、PBS中の5% goatと1% bovine serum albuminで1時間ブロッキングした。 サンプルをPBSで2回、それぞれ10分間洗浄した。 PBS中の1％ウシ血清アルブミンで希釈した一次抗体、COX2（1：1000希釈）またはカスパーゼ-3（1：1000希釈）とともに、4℃で一晩インキュベートした。 PBSで4回洗浄した後、PBS中の1%BSAで希釈した二次抗体（マウスとウサギ、Alexa Fluor 2nd ab、1 : 500）と共に時系列に室温、暗所で2時間インキュベートした。 最後に、サンプルをPBSで2分間2回洗浄し、DAPIを含むマウント媒体で覆った。 画像は、Zeiss Axiovert顕微鏡（Zeiss、ドイツ）およびAxiovision Rel.4.5 Analysis System（Zeiss、ドイツ）を使用して取得した
3. 結果と考察
3.1. Pain Measurement Scheme
電気刺激については、ラットを抱水クロラール（300mg/kg）により腹腔内注射で麻酔し、ラットの毛を抜いた。 図2（a）に示すように、ラットの右脇腹に電気刺激用の心電図電極を取り付けた。 ラットの左脇腹に電気刺激を加えた。 印加電圧は0〜50Vまで徐々に増加させた。各ラットで測定した電流値は、図2(b)に示すように12.5〜92μAであった。 なお、電気刺激は麻酔下で行ったため、ラットの応答行動は観察されなかった。 しかし、ラットの生理的要因に関係する電圧、電流、抵抗値を特定することで、身体や皮膚の状態に関わらず、常に刺激を測定できることが期待される。
(a)
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(c)
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圧力ドロリメーター試験において、図2（c）に示すように、ラットを麻酔薬のない拘束室内に入れた。 右後肢にカラギーナンを注射し、炎症を誘発させた。 カラギーナンは侵害受容性疼痛の確認に使用した。 また、作った装置は、まず侵害受容性疼痛を確認するために作ったものである。 カラギーナンの量は1％（w/v）溶液を100μlから200μlまで増やし、炎症レベルをコントロールした。 対照として、生理食塩水100μlを左後肢の足蹠に注射した。 炎症を起こしている右後肢を、図S1に示すように、ハンドタイプの圧力刺激装置で刺激した。 ラットは圧力刺激に反応した。 我々の仮説は、ラットの圧力反応の閾値は、炎症の程度に依存するというものである。 ラットの後肢における炎症発現は、臨床における疾患レベルを模倣している。 カラギーナン注入後の各時点で、炎症に応じた後肢の体積と大きさの増加を測定した。 後肢の体積はプレチスモグラフィー（model 7140 plethysmometer, Ugo Basile, Italy）により測定し、ノギス（model CD-6P; Mitutoyo, Tokyo, Japan）を用いて各ラットの足の幅と厚さを測定した。 圧力刺激は，炎症発現が最大となった時点で行った． 圧力レベルを上げることでラットの反応を観察し、圧力の閾値と炎症の程度を比較した。 電気刺激
電気刺激がラットを傷つけず痛みだけを誘発することを確認するため、刺激した組織を組織学的に調べ、炎症を観察した。 図3は、0から50Vまで電圧を上昇させて電気刺激を与えた組織のH&E染色による巨視的画像である。 一群の組織は電気刺激直後に染色し（左列）、もう一群は刺激から1日後に染色した（右列）
対照群では正常な脇腹組織が見られた。 電気刺激後24時間経過した組織では、電圧が50Vに上昇しても、対照組織と比較して異常は観察されなかった。 電気刺激による炎症とアポトーシスの両作用を、カスパーゼ-3とCOX-2の二重免疫蛍光染色で調べた。 図4は、正常組織（非刺激）と刺激（10Vと50Vで）組織の二重免疫蛍光染色の結果を示す。 電気刺激直後や1日後の組織には炎症発現やアポトーシスは見られず、電気刺激は痛みを与えるだけで、組織障害を誘発しないことが確認された。
3.3. 圧力ドロリメーター＜6156＞＜1653＞ラットの右後肢をカラギーナンで処理して炎症を誘発し、図5に示すように、後肢を上面および側面から撮影した。 対照としてカラギーナンで処理しない群、陰性対照として生理食塩水で処理した群を設けた（図5（a））。 1％カラギーナンを100μl、150μl、200μlと量を変えながら注入した。 カラギーナンで処理したすべての後肢に浮腫と発赤の炎症症状が認められたが、対照群および生理食塩水処理群には症状が認められなかった。 カラギーナンの炎症作用は、H&E染色により明確に明らかになった。 図5(b)に示すように、対照群および生理食塩水処理群では、健全な組織状態を示した。 しかし、すべてのカラギーナン処理群では、矢印で示すように浸潤した炎症細胞の集積が観察された。 右画像はコントロール、生理食塩水、カラギーナンに用いたラットの右後肢、左画像は図5（b）のラットの左後肢である。
図5
カラギーナンによるラットの足浮腫の影響． 対照群、生理食塩水処理群、1％100μlカラギーナン処理群、150μl1％カラギーナン処理群、1％200μlカラギーナン処理群の後肢の代表的な（a）マクロ写真と（b）組織写真。
炎症進行中、後肢の体積とサイズ（横×縦）をプレチスモグラフィーとノギスを使用して測定した。 測定は生理食塩水とカラギーナンの注射直後に行い、その後8時間継続した。 カラギーナン投与群では、6時間までは後肢の体積・サイズともに時間とともに漸増したが、さらに時間が経過すると浮腫は減少した（図6（a）、（b））。 対照群および生理食塩水投与群では、体積およびサイズに変化は見られなかった。 カラギーナン注入濃度に応じた浮腫（図6（a）、（b））を測定した後、カラギーナン注入6時間後の浮腫の最大状態（図6（c））においてラットの作用相（圧力）を確認した。 この測定は、臨床的な炎症状態に関する様々な情報を収集するために行ったものである。 対照群および生理食塩水群では、圧力試験の結果に大きな変化は見られなかった。 カラギーナン投与足浮腫群では、観察された炎症の状態によって圧力値の違いを識別することができました。 これらの結果から、様々な炎症レベルに応じて痛みの程度を判断することができることがわかりました。 本研究では、カラギーナンを用いて急性炎症を評価しました。慢性炎症の評価は、Complete Freund’s Adjuvantを用いて評価する予定です。
(a)
(b)
(c)
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(b)
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4.Conclusions
客観的かつ定量的な疼痛評価のために疼痛測定システムを開発した。 クロスバリデーションのため、システムは電気刺激と圧力の両要素から構成された。 本システムを臨床応用する前に、動物モデルを用いてシステムの安全性と信頼性を確認した。 電気刺激では、組織の炎症やアポトーシスなどのダメージは見られなかった。 また、加圧試験では、炎症の程度によって測定される圧力の値が異なることが確認されました。 当社の疼痛測定システムは、測定時間が短く、ラットの組織に適用しても炎症が誘発されない。 現在、研究開発は完了し、製品化の準備が整っています。 最もよく使われるのは侵害受容性疼痛になります。 リハビリテーション科で使われていますが、今後は脳外科の痛み（神経因性疼痛）にも応用される予定です。 多くの課題が残っているが、この疼痛測定システムは、様々な疾患の診断や治療にエキサイティングな機会を提供する可能性がある。
Conflicts of Interest
The authors declare that they have no conflict of interest.著者らは、利益相反がないことを宣言する。
謝辞
この研究は、科学・ICT・未来計画省「ソフトウェア融合技術開発プログラム」（ITAS0177160110290001000200）と韓国貿易産業エネルギー省「創造的産業融合教育プログラム」（Grant No.）の支援を受けています。 N0000717）、韓国政府教育科学技術部による韓国国立研究財団（NRF）助成金（番号2011-0030072）。
Supplement Materials
本論文に関連する補足データは、オンライン版に掲載されているものである。 図S1: 圧力センサーと表示部品を備えたハンドタイプの圧力ドロリメーター。 図S2】100μlの注入量後のカラギーナン誘発足浮腫の時間経過を示す画像である。 図S3】150μlの注入量後のカラギーナン誘発性肉眼浮腫の時間経過を示す画像である。 図S4】200μl注入後のカラギーナン誘発性肉眼浮腫の時間経過を示す画像である。 (補足資料)
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