Abstract
La comprensión y la evaluación precisa del nivel de dolor son factores clave en la terapia de rehabilitación. El dolor es una experiencia compleja y subjetiva que se ve afectada por la emoción y las condiciones de salud del individuo. Se han desarrollado varios métodos para la evaluación cuantitativa del nivel de dolor; sin embargo, estos métodos tienen varios inconvenientes. En este trabajo, desarrollamos un dispositivo de medición del dolor para la evaluación cuantitativa del mismo. El sistema consta de dos partes, un componente para la estimulación eléctrica y un dolorímetro de presión, para la aplicación de dos tensiones diferentes. En cuanto a la estimulación eléctrica, el grado de dolor se evalúa mediante la corriente aplicada. También se analizó la resistencia de la piel mediante la aplicación de corriente para eliminar los efectos causados por las condiciones de la piel. La estimulación eléctrica no indujo ningún cambio histológico ni inflamación en los tejidos. Utilizando el dolorímetro de presión, se evaluó el nivel de dolor según el grado de inflamación. Este sistema podría utilizarse para la evaluación cuantitativa del dolor inducido por la inflamación, las heridas y otros factores. Dado que el sistema descrito es el primero de su clase, quedan muchos problemas por resolver. Sin embargo, con un desarrollo continuo, nuestro sistema podría proporcionar una evaluación del dolor más precisa mediante la eliminación de los efectos del estado de la piel y a través de la validación cruzada.
1. Introducción
La evaluación de la escala de dolor de un paciente es una cuestión importante durante la rehabilitación. Sin embargo, la medición del dolor es difícil porque es una sensación compleja asociada a las características personales y a la experiencia . Se han desarrollado varios métodos para evaluar la escala de dolor, incluyendo la Escala Visual Análoga (EVA), la Escala de Calificación Numérica (NRS), la Escala de Calificación Verbal (VRS), la Escala de Calificación del Dolor de FACES (FPRS) y el Cuestionario del Dolor de McGill (MPQ) . Entre ellos, la EVA y la FPRS se han utilizado principalmente en el ámbito clínico. La EVA está diseñada como una línea recta de longitud fija, de 10 centímetros. Los extremos se definen como los límites extremos del parámetro a medir orientados desde «ningún dolor» hasta el «peor dolor imaginable». Los pacientes marcan en la línea correspondiente a la intensidad del dolor que experimentan actualmente. El NRS indica a los pacientes que elijan el número de 0 a 10 que mejor describa la intensidad de su dolor actual. 0 significa «ningún dolor» y 10 «el peor dolor posible». El VRS es un método de evaluación del dolor que se expresa con palabras en lugar de números. Los pacientes eligen una frase como «sin dolor», «dolor moderado», «dolor intenso», «dolor muy intenso» y «el peor dolor posible» para describir su sensación de dolor. La FPRS es una escala de dolor de seis puntos con seis caras diferentes que representan niveles de dolor crecientes. Se pide a los pacientes que seleccionen la expresión que mejor caracterice la intensidad del dolor, desde «sin dolor» hasta «dolor intenso». Todos estos métodos son subjetivos y dependen de la experiencia personal y la emoción. Por lo tanto, existen considerables variaciones individuales en el dolor evaluado que dan lugar a una difícil evaluación cuantitativa.
Recientemente, se ha introducido un método cuantitativo de evaluación del dolor mediante estimulación eléctrica . Los dispositivos PainVision™ miden el umbral de percepción y el dolor producido por una corriente eléctrica. Este sistema cuantifica la intensidad del dolor comparando el dolor experimentado con la intensidad de las percepciones eléctricas. El umbral de percepción indica la corriente eléctrica mínima percibida por el individuo, y el dolor producido se define como la corriente eléctrica máxima percibida por el individuo. Sin embargo, la resistencia de la piel de un individuo puede afectar al resultado de la medición eléctrica.
Los factores más importantes en el desarrollo de un dispositivo de medición del dolor son la objetividad, la precisión y la evaluación cuantitativa. PainVision es un sistema que permite a los pacientes realizar mediciones independientemente de la resistencia de la piel. La resistencia de la piel varía según el estado y el entorno del paciente. Es difícil explicar la correlación con las mediciones anteriores si el dolor se mide sin tener en cuenta la resistencia de la piel. Pero, nuestro sistema mide a partir de la resistencia cutánea del paciente antes de medir el dolor.
Después de determinar el valor de resistencia cutánea de referencia del paciente, se mide el dolor. Es decir, el valor de resistencia de la piel es un estándar. Cuando se prepara el valor de referencia, se hace posible una descripción de la correlación de los valores de dolor medidos antes y después de la medición del dolor.
En este trabajo, desarrollamos un dispositivo de medición del dolor que tiene dos métodos de análisis, la estimulación eléctrica y la aplicación de presión, para una evaluación de validación cruzada más precisa. Durante la estimulación eléctrica, se aplica una tensión eléctrica en un lugar no doloroso y luego la tensión observada puede compararse con el dolor. Los tejidos sometidos a tensión eléctrica se examinaron histológicamente para identificar si la estimulación eléctrica causaba daños en los tejidos. Durante la evaluación de la presión, el dolor se evaluó aplicando presión en el lugar del dolor. Se indujo la inflamación en la pata trasera de la rata mediante carragenina y, a continuación, se estimuló la pata trasera inflamada con un estimulador de presión de tipo manual. A continuación se comparó el lugar de presión con los niveles de inflamación.
2. Material y métodos
2.1. Principio y componentes del dispositivo de medición del dolor
El dispositivo de medición del dolor se desarrolló para el análisis cuantitativo del dolor. El dispositivo consta de dos partes principales que incluyen un componente para la estimulación eléctrica y un dolorímetro de presión, como se muestra en la Figura 1. La estimulación puede aplicarse por separado al individuo, ya sea eléctricamente o mediante presión. Comparando la respuesta a la estimulación eléctrica y a la presión, podríamos obtener resultados más precisos. Durante la estimulación eléctrica, el dolor experimentado por los pacientes se sustituye por la estimulación eléctrica; es decir, el valor de la corriente aplicada se traduce en un valor de dolor experimentado o vivenciado. Además, al evaluar la estimulación eléctrica y la resistencia de la piel al mismo tiempo, esperamos evaluar objetivamente el dolor a pesar de las condiciones variables, como los cambios en la piel y el cuerpo, el tiempo o las condiciones ambientales. Al utilizar el dolorímetro de presión, la presión se aplica directamente en el lugar del dolor y la aparición del dolor se mide por la cantidad de presión.
El dispositivo de medición del dolor utiliza cinco botones que incluyen el de encendido, el ES (estimulación eléctrica), el PS (estimulación por presión), el EB (botón de emergencia) y el SS (interruptor de parada). ES y PS se utilizan para aplicar la estimulación eléctrica y de presión al individuo. EB es un botón de apagado disponible en caso de emergencia, y SS es un botón utilizado al final de las mediciones del dolor. El componente de estimulación eléctrica se conectó con dos electrodos para medir la corriente percibida (50 Hz, ancho de pulso 0,3 ms) y el umbral del dolor. Los dos electrodos se colocan en un lugar plano, como el flanco de un animal o el antebrazo medial de un humano. El sistema de estimulación eléctrica proporciona el mismo nivel de estimulación e intensidad de estímulo que el dolor; la fibra Ad conduce principalmente la señal de dolor (señal eléctrica). El dolorímetro de presión está conectado a un sensor de presión tipo punta de un estimulador de mano. El interruptor de parada se pulsaba cuando el participante sentía dolor.
2.2. Preparación del modelo animal
Ratas Sprague-Dawley macho adultas (Raon Bio. Inc., Yongin, Corea) con un peso de 250-350 g y 49-56 días de edad se mantuvieron bajo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad (luces a las 06:00 h) a 24 ± 0,5°C en una instalación central de cuidado de animales. Se les proporcionó agua y comida para ratas ad libitum hasta que comenzaron los experimentos. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-084), y fueron tratados en estricta conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
2.3. Examen histológico
Las ratas fueron estimuladas eléctricamente o tratadas con carragenina para inducir el dolor. Las respuestas inflamatorias inducidas por los dos tratamientos diferentes se compararon mediante una evaluación histológica. Se perfundió a las ratas por vía intracardiaca con PBS frío que contenía heparina (0,2 U/ml) y paraformaldehído al 4% y luego se almacenó en paraformaldehído al 4%. Los tejidos estresados resultantes de la estimulación eléctrica y de la carragenina se dividieron en dos y se colocaron en casetes de incrustación. Cada muestra se incrustó en cera de parafina y luego se seccionó en muestras de 5 μm de grosor utilizando un microtomo rotatorio (HM340E, Microm, Walldorf, Alemania). La muestra seccionada se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) y luego se analizó bajo un microscopio de investigación invertido Nikon Ti-E y una cámara digital Nikon Ds-Ri1 controlada por el software Nis-Elements (Br) (Nikon Inc., Kawasaki, Japón).
2.4. Tinción de inmunofluorescencia
Los efectos de la estimulación eléctrica sobre la inflamación y la apoptosis de los tejidos se investigaron mediante inmunofluorescencia. El tejido del flanco de las ratas estimulado eléctricamente se incrustó en parafina y se seccionó en muestras de 4 μm de grosor. Para la recuperación de antígenos, las secciones de tejido se calentaron en tampón TRS durante aproximadamente diez minutos y luego se lavaron con agua destilada tres veces. Las muestras se trataron con H2O2 al 0,03% para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena y luego se lavaron con solución PBS. A continuación, las muestras se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,5% en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5% y al 1% en PBS durante una hora. Las muestras se lavaron con PBS dos veces durante diez minutos cada una. Las muestras se incubaron durante la noche a 4°C con un anticuerpo primario, ya sea COX2 (diluido 1 : 1000) o caspasa-3 (diluido 1 : 1000), diluido en albúmina de suero bovino al 1% en PBS. Las muestras se lavaron cuatro veces con PBS y luego se incubaron en orden cronológico con el anticuerpo secundario (ratón y conejo, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) diluido en BSA al 1% en PBS a temperatura ambiente y en la oscuridad durante dos horas. Por último, las muestras se lavaron dos veces con PBS durante dos minutos y se cubrieron con un medio de montaje que contenía DAPI. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Zeiss Axiovert (Zeiss, Alemania) y un sistema de análisis Axiovision Rel. 4.5 (Zeiss, Alemania).
3. Resultados y discusión
3.1. Esquema de medición del dolor
Para la estimulación eléctrica, se anestesió a las ratas mediante una inyección intraperitoneal utilizando hidrato de cloral (300 mg/kg), y se les quitó el pelo. Se colocó el electrodo de ECG en el flanco derecho de la rata para la estimulación eléctrica, como se muestra en la Figura 2(a). La estimulación eléctrica se aplicó en el flanco izquierdo de la rata. El voltaje aplicado se incrementó gradualmente de 0 a 50 V. El valor de la corriente medida en cada rata osciló entre 12,5 y 92 μA, como se muestra en la Figura 2(b). No se observó el comportamiento de respuesta de la rata porque la estimulación eléctrica se realizó bajo anestesia. Sin embargo, esperamos que la estimulación siempre se puede medir independientemente de la condición física o de la piel mediante la identificación de la tensión, la corriente y la resistencia relacionada con los factores fisiológicos de la rata.
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En la prueba del dolorímetro de presión, la rata se colocó en una cámara de sujeción sin anestesia, como se muestra en la Figura 2(c). La inflamación se indujo mediante la inyección de carragenina en la pata trasera derecha. La carragenina se utilizó para confirmar el dolor nociceptivo. El equipo que construimos también se hizo para identificar primero el dolor nociceptivo. Los niveles de inflamación se controlaron mediante la cantidad de carragenina, que se aumentó de 100 a 200 μl de una solución al 1% (p/v). Se inyectaron 100 μl de solución salina en la región intraplantar de la pata trasera izquierda como control. Se estimuló la pata trasera derecha inflamada con un estimulador de presión de tipo manual, como se muestra en la Figura S1. La rata respondió a la estimulación por presión. Nuestra hipótesis es que el umbral de la respuesta a la presión en la rata depende del grado de inflamación. La expresión de la inflamación en la pata trasera de la rata imita los niveles de la enfermedad en la práctica clínica. Se midieron los aumentos de volumen y tamaño de la pata trasera en función de la inflamación en cada punto temporal tras la inyección de carragenina. Los volúmenes de las patas traseras se midieron mediante pletismometría (modelo 7140 plethysmometer, Ugo Basile, Italia), y se utilizaron calibradores (modelo CD-6P; Mitutoyo, Tokio, Japón) para medir la anchura y el grosor de las patas de cada rata. La estimulación por presión se aplicó cuando la expresión de la inflamación alcanzó el máximo. La respuesta de la rata se observó aumentando el nivel de presión, y el umbral de presión se comparó con el grado de inflamación.
3.2. Estimulación eléctrica
Para verificar que la estimulación eléctrica aplicada inducía únicamente dolor sin dañar a la rata, se examinaron los tejidos estimulados en términos de histología e inflamación. La figura 3 muestra las imágenes macroscópicas de los tejidos teñidos con H&E que fueron estimulados eléctricamente aumentando el voltaje de 0 a 50 V. Un grupo de los tejidos se tiñó inmediatamente después de la estimulación eléctrica (columna de la izquierda), y el otro se tiñó un día después de la estimulación (columna de la derecha).
El grupo de control mostró un tejido del flanco normal. No se observaron diferencias en los tejidos sometidos a estrés eléctrico en comparación con el tejido de control, a pesar de que el voltaje aumentó a 50 V. No se observaron anomalías 24 horas después de la estimulación eléctrica. Los efectos inflamatorios y apoptóticos de la estimulación eléctrica se examinaron mediante tinción de doble inmunofluorescencia para caspasa-3 y COX-2. La figura 4 muestra los resultados de la tinción de inmunofluorescencia doble para tejidos normales (no estimulados) y estimulados (a 10 y 50 V). No hubo expresión de inflamación ni apoptosis en los tejidos inmediatamente después de la estimulación eléctrica ni después de un día, lo que confirma que la estimulación eléctrica sólo causó dolor y no indujo daños en los tejidos.
3.3. Dolorímetro de presión
La pata trasera derecha de la rata se trató con carragenina para inducir la inflamación, y la pata trasera se fotografió desde las vistas superior y lateral, como se muestra en la Figura 5. Un grupo no fue tratado con carragenina como control, y el otro fue tratado con solución salina como control negativo (Figura 5(a)). Se inyectó carragenina al 1% en cantidades variables de 100 μl, 150 μl y 200 μl. Los síntomas inflamatorios de edema y enrojecimiento se observaron en todas las patas traseras tratadas con carragenina, mientras que los grupos de control y tratados con solución salina no mostraron síntomas. El efecto inflamatorio de la carragenina se reveló claramente mediante la tinción H&E. Como se muestra en la Figura 5(b), los grupos de control y tratados con solución salina mostraron un estado tisular sano. Sin embargo, se observó la acumulación de células inflamatorias infiltradas en todos los grupos tratados con carragenina, como indican las flechas. La imagen de la derecha es una pata trasera derecha de una rata utilizada para el control, la solución salina y la carragenina, y la imagen de la izquierda es una pata trasera izquierda de la rata de la Figura 5(b).
Durante el progreso de la inflamación, se midió tanto el volumen como el tamaño (anchura × altura) de la pata trasera utilizando pletismometría y calibradores. La medición se llevó a cabo inmediatamente después de la inyección de solución salina y carragenina y luego se continuó durante ocho horas. En todos los grupos tratados con carragenina, tanto el volumen como el tamaño de las patas traseras aumentaron progresivamente con el tiempo hasta las 6 horas; sin embargo, el edema disminuyó al aumentar el tiempo (Figuras 6(a) y 6(b)). Los grupos de control y tratado con solución salina no mostraron cambios en el volumen y el tamaño. Después de medir el edema (Figuras 6(a) y 6(b)) en función de la concentración de la inyección de carragenina, confirmamos el aspecto de acción de la rata (presión) en el estado máximo de edema 6 h después de la inyección de carragenina (Figura 6(c)). Esta medición se realizó para recoger una serie de informaciones sobre el estado de inflamación clínica. En los grupos de control y de solución salina, los resultados de la prueba de presión no mostraron cambios significativos. En el grupo de edema de pata inducido por carragenina, pudimos distinguir diferencias en los valores de presión en función de la inflamación observada. Estos resultados indican que pudimos determinar el grado de dolor según los distintos niveles de inflamación. En este estudio, se utilizó carragenina para evaluar la inflamación aguda; la evaluación de la inflamación crónica se evaluará utilizando el adyuvante completo de Freund.
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4. Conclusiones
Desarrollamos un sistema de medición del dolor para su evaluación objetiva y cuantitativa. Para la validación cruzada, el sistema constaba de componentes de estimulación eléctrica y de presión. Antes de aplicar este sistema en un entorno clínico, se confirmó la seguridad y fiabilidad del sistema utilizando un modelo animal. La estimulación eléctrica no causó ningún daño, incluyendo la inflamación del tejido y la apoptosis. En la prueba de presión, los valores de presión medidos dependían del grado de inflamación. Nuestro sistema de medición del dolor requiere un tiempo de medición corto y no indujo la inflamación cuando se aplicó al tejido de la rata. En la actualidad, nuestra investigación y desarrollo se ha completado y está lista para su comercialización. La parte más utilizada será el dolor nociceptivo. Se utiliza en el departamento de medicina de rehabilitación, y en el futuro se aplicará el dolor neuroquirúrgico (dolor neuropático). Aunque siguen existiendo muchos retos, este sistema de medición del dolor puede ofrecer interesantes oportunidades para el diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el «Programa de Desarrollo de Tecnología de Convergencia de Software», a través del Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro (ITAS0177160110290001000200) y el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE), Corea, a través del Programa de Educación para la Convergencia Creativa e Industrial (Grant no. N0000717) y la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología del gobierno coreano (nº 2011-0030072).
Materiales complementarios
Los datos complementarios asociados a este artículo pueden encontrarse en la versión online. Figura S1: el dolorímetro de presión de tipo manual con los componentes del sensor de presión y la pantalla. Figura S2: una imagen que muestra el curso temporal del edema de la pata inducido por carragenina después de un volumen de inyección de 100 μl. Figura S3: una imagen que muestra el curso temporal del edema de la pata inducido por carragenina después de un volumen de inyección de 150 μl. Figura S4: una imagen que muestra el curso temporal del edema de la pata inducido por carragenina después de un volumen de inyección de 200 μl. (Materiales suplementarios)