Abstract
Förståelse och exakt bedömning av smärtnivån är nyckelfaktorer i rehabiliteringsterapi. Smärta är en komplex och subjektiv upplevelse som påverkas av en individs känslor och hälsotillstånd. Olika metoder har utvecklats för kvantitativ utvärdering av smärtnivån; dessa metoder har dock flera nackdelar. I det här arbetet har vi utvecklat en smärtmätningsanordning för kvantitativ smärtbedömning. Systemet består av två delar, en komponent för elektrisk stimulering och en tryckdolorimeter, för applicering av två olika spänningar. När det gäller elektrisk stimulering bedöms graden av smärta med hjälp av den applicerade strömmen. Hudmotståndet analyserades också genom att applicera ström för att avlägsna de effekter som orsakas av hudförhållanden. Den elektriska stimuleringen framkallade inga histologiska förändringar eller inflammationer i vävnaderna. Med hjälp av tryckdolorimetern bedömdes smärtnivån enligt graden av inflammation. Detta system skulle kunna användas för kvantitativ bedömning av smärta som induceras av inflammation, sår och andra faktorer. Eftersom det beskrivna systemet är det första i sitt slag finns det många problem som återstår att lösa. Med kontinuerlig utveckling skulle vårt system dock kunna ge en mer exakt smärtbedömning genom att ta bort effekter av hudtillstånd och genom korsvalidering.
1. Introduktion
Bedömning av en patients smärtskala är en viktig fråga under rehabilitering. Smärtmätning är dock svår eftersom det är en komplex känsla som är förknippad med personliga egenskaper och erfarenheter . Olika metoder har utvecklats för att bedöma smärtskalan, inklusive Visual Analog Scale (VAS), Numerical Rating Scale (NRS), Verbal Rating Scale (VRS), FACES Pain Rating Scale (FPRS) och McGill Pain Questionnaire (MPQ) . Bland dem har VAS och FPRS främst använts i kliniska sammanhang . VAS är utformad som en rak linje med en fast längd på 10 centimeter. Ändarna definieras som de extrema gränserna för den parameter som ska mätas, från ”ingen smärta” till ”värsta tänkbara smärta”. Patienterna markerar på linjen motsvarande den intensitet av smärta som de för närvarande upplever. NRS instruerar patienterna att välja en siffra från 0 till 10 som bäst beskriver deras nuvarande smärtintensitet. 0 betyder ”ingen smärta” och 10 betyder ”värsta tänkbara smärta”. VRS är en metod för smärtbedömning som uttrycks med ord i stället för siffror. Patienterna väljer en mening som ingen smärta, måttlig smärta, svår smärta, mycket svår smärta och värsta möjliga smärta för att beskriva sin smärtkänsla. FPRS är en sexgradig smärtskala med sex olika ansikten som representerar ökande smärtnivåer. Patienterna ombeds att välja det uttryck som bäst karaktäriserar smärtintensiteten, från ”ingen smärta” till ”svår smärta”. Alla dessa metoder är subjektiva och beror på personliga erfarenheter och känslor. Därför finns det betydande individuella variationer i bedömd smärta som resulterar i svår kvantitativ utvärdering.
Nyligen introducerades en kvantitativ smärtbedömningsmetod med elektrisk stimulering . PainVision™-apparater mäter perceptionströskeln och den smärta som produceras av en elektrisk ström. Detta system kvantifierar smärtintensiteten genom att jämföra den upplevda smärtan med intensiteten av de elektriska perceptionerna. Tröskelvärdet anger den minsta elektriska strömmen som uppfattas av individen, och den producerade smärtan definieras som den maximala elektriska strömmen som uppfattas av individen. En individs hudmotstånd kan dock påverka det elektriska mätresultatet .
De viktigaste faktorerna vid utvecklingen av en anordning för smärtmätning är objektivitet, noggrannhet och kvantitativ bedömning. PainVision är ett system som gör det möjligt för patienter att göra mätningar oberoende av hudmotstånd. Hudmotståndet varierar med patientens tillstånd och miljö. Det är svårt att förklara korrelationen med tidigare mätningar om smärtan mäts utan hänsyn till hudmotståndet. Men vårt system mäter från patientens hudmotstånd innan smärtan mäts.
När patientens baslinjevärde för hudmotstånd har fastställts mäts smärtan. Det vill säga, hudmotståndsvärdet är en standard. När referensvärdet är förberett blir det möjligt att beskriva korrelationen mellan de smärtvärden som mäts före och efter smärtmätningen.
I detta arbete har vi utvecklat en smärtmätningsanordning som har två analysmetoder, elektrisk stimulering och applicering av tryck, för en noggrannare korsvalidationsbedömning. Vid elektrisk stimulering appliceras elektrisk spänning på en plats som inte är smärtfri och sedan kan den observerade spänningen jämföras med smärta. De elektriskt stressade vävnaderna undersöktes histologiskt för att identifiera om den elektriska stimuleringen orsakade vävnadsskador. Under tryckutvärderingen bedömdes smärta genom att applicera tryck på smärtstället. Inflammation inducerades på råttans bakfot med karrageenan, och sedan stimulerades den inflammerade bakfoten med en tryckstimulator av handtyp. Tryckstället jämfördes sedan med inflammationsnivåerna.
2. Material och metoder
2.1. Principen och komponenterna i anordningen för smärtmätning
Anordningen för smärtmätning utvecklades för kvantitativ smärtanalys. Anordningen består av två huvuddelar inklusive en komponent för elektrisk stimulering och en tryckdolorimeter, enligt figur 1. Stimulering kunde separat appliceras på individen antingen elektriskt eller via tryck. Genom att jämföra svaret på den elektriska stimuleringen och trycket kunde man få mer exakta resultat. Vid elektrisk stimulering ersätts den smärta som patienterna upplever med elektrisk stimulering, dvs. det applicerade strömvärdet översätts till ett upplevt eller upplevt smärtvärde. Genom att utvärdera den elektriska stimuleringen och hudmotståndet samtidigt förväntar vi oss också att objektivt kunna utvärdera smärta trots varierande förhållanden, t.ex. förändringar i hud och kropp, väder eller miljöförhållanden. Vid användning av tryckdolorimetern appliceras trycket direkt på smärtstället och smärtans uppkomst mäts med hjälp av tryckmängden.
Smärtmätningsanordningen använder fem knappar, inklusive ström, ES (elektrisk stimulering), PS (tryckstimulering), EB (nödknapp) och SS (stoppbrytare). ES och PS används för att applicera elektrisk stimulering och tryckstimulering på individen. EB är en strömavstängningsknapp som finns tillgänglig i nödfall, och SS är en knapp som används i slutet av smärtmätningarna. Den elektriska stimuleringskomponenten var ansluten till två elektroder för att mäta den upplevda strömmen (50 Hz, pulsbredd 0,3 ms) och smärttröskeln. De två elektroderna placeras på ett plant ställe, t.ex. flanken på ett djur eller mediala underarmen på en människa. Det elektriska stimuleringssystemet ger samma nivå av stimulering och stimulansintensitet som smärta; Ad-fibern leder i första hand smärtsignalen (elektrisk signal). Tryckdolorimetern är ansluten till en trycksensor av spetstyp i en handstimulator. Stoppknappen trycktes på när deltagaren kände smärta.
2.2. Förberedelse av djurmodell
Vuxna manliga Sprague-Dawley-råttor (Raon Bio. Inc., Yongin, Korea) med en vikt på 250-350 g och en ålder på 49-56 dagar hölls under en 12 timmars ljus-/12 timmars mörkercykel (ljus kl. 06:00) vid 24 ± 0,5 °C i en central djurhållningsanläggning. Vatten och råttmat tillhandahölls ad libitum tills experimenten påbörjades. Alla djurförsök godkändes av kommittén för djurförsök vid College of Medicine, Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-084) och behandlades i strikt överensstämmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
2.3. Histologisk undersökning
Råttor stimulerades antingen elektriskt eller behandlades med karrageenan för att framkalla smärta. De inflammatoriska reaktioner som inducerades av de två olika behandlingarna jämfördes genom histologisk utvärdering. Råttor perfunderades intrakardialt med kall PBS innehållande heparin (0,2 U/ml) och 4 % paraformaldehyd och lagrades sedan i 4 % paraformaldehyd. De stressade vävnaderna till följd av elektrisk stimulering och stimulering med karrageenan delades i två delar och placerades i inbäddningskassetter. Varje prov bäddades in i paraffinvax och sektionerades sedan i 5 μm tjocka prover med hjälp av en roterande mikrotom (HM340E, Microm, Walldorf, Tyskland). Det sektionerade provet färgades med hematoxylin och eosin (H&E) och analyserades sedan i ett Nikon inverterat forskningsmikroskop Ti-E och en Nikon Ds-Ri1 digitalkamera som styrdes av programvaran Nis-Elements (Br) (Nikon Inc., Kawasaki, Japan).
2.4. Immunofluorescensfärgning
Effekterna av elektrisk stimulering på inflammation och apoptos i vävnaderna undersöktes genom immunofluorescens. Den elektriskt stimulerade flankvävnaden från råttor bäddades in i paraffin och sektionerades i 4 μm tjocka prover. För antigenhämtning värmdes vävnadssektionerna i TRS-buffert i cirka tio minuter och tvättades sedan med destillerat vatten tre gånger. Proverna behandlades med 0,03 % H2O2 för att hämma endogen peroxidasaktivitet och tvättades sedan med PBS-lösning. Därefter permeabiliserades proverna med 0,5 % Triton X-100 i PBS i tio minuter i rumstemperatur och blockerades med 5 % get- och 1 % bovint serumalbumin i PBS i en timme. Proverna tvättades med PBS två gånger i tio minuter vardera. Proverna inkuberades över natten vid 4 °C med en primär antikropp, antingen COX2 (utspädd 1:1000) eller caspase-3 (utspädd 1:1000), utspädd i 1 % bovint serumalbumin i PBS. Proverna tvättades fyra gånger med PBS och inkuberades sedan i kronologisk ordning med sekundära antikroppar (mus och kanin, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) utspädda i 1 % BSA i PBS i rumstemperatur i mörker i två timmar. Slutligen tvättades proverna två gånger med PBS i två minuter och täcktes sedan med DAPI-innehållande monteringsmedium. Bilderna togs med hjälp av ett Zeiss Axiovert-mikroskop (Zeiss, Tyskland) och Axiovision Rel. 4.5 Analysis System (Zeiss, Tyskland).
3. Resultat och diskussion
3.1. Smärtmätningsschema
För elektrisk stimulering sövdes råttorna via intraperitoneal injektion med kloralhydrat (300 mg/kg) och råttans hår avlägsnades. EKG-elektroden fästes på råttans högra flank för elektrisk stimulering, enligt figur 2(a). Den elektriska stimuleringen applicerades på råttans vänstra flank. Den applicerade spänningen ökades gradvis från 0 till 50 V. Det uppmätta strömvärdet hos varje råtta varierade mellan 12,5 och 92 μA (se figur 2 b). Råttans svarsbeteende observerades inte eftersom den elektriska stimuleringen utfördes under bedövning. Vi förväntar oss dock att stimuleringen alltid kan mätas oavsett fysiskt tillstånd eller hudtillstånd genom att identifiera spänning, ström och motstånd relaterade till råttans fysiologiska faktorer.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
I tryckdolorimetertestet placerades råttan i en spännkammare utan bedövningsmedel, vilket visas i figur 2(c). Inflammation framkallades genom injektion av karrageenan i höger bakfot. Carrageenan användes för att bekräfta nociceptiv smärta. Den utrustning vi byggde gjordes också för att först identifiera den nociceptiva smärtan. Inflammationsnivåerna kontrollerades av mängden carrageenan, som ökades från 100 till 200 μl av en 1 % (w/v) lösning. 100 μl saltlösning injicerades i det intraplanta området på den vänstra bakfoten som kontroll. Den inflammerade högra bakfoten stimulerades med en tryckstimulator av handtyp, enligt figur S1. Råttan reagerade på tryckstimuleringen. Vår hypotes är att tröskeln för tryckreaktionen hos råttan beror på graden av inflammation. Inflammationsuttrycket i råttans baktass efterliknar sjukdomsnivåerna i klinisk praxis. Ökningen av baktassens volym och storlek beroende på inflammation mättes vid varje tidpunkt efter injektionen av karrageenan. Volymerna i bakfötterna mättes med plethysmometri (modell 7140 plethysmometer, Ugo Basile, Italien), och kalibrar (modell CD-6P, Mitutoyo, Tokyo, Japan) användes för att mäta bredden och tjockleken på varje råttas tassar. Tryckstimuleringen tillämpades när inflammationsuttrycket nådde sitt maximum. Råttans reaktion observerades genom att öka trycknivån, och trycktröskeln jämfördes med inflammationsgraden.
3.2. Elektrisk stimulering
För att verifiera att den applicerade elektriska stimuleringen endast framkallade smärta utan att skada råttan undersöktes de stimulerade vävnaderna med avseende på histologi och inflammation. Figur 3 visar makroskopiska bilder av H&E-färgade vävnader som stimulerades elektriskt genom att öka spänningen från 0 till 50 V. En grupp av vävnaderna färgades omedelbart efter den elektriska stimuleringen (vänster kolumn) och den andra gruppen färgades en dag efter stimuleringen (höger kolumn).
Kontrollgruppen visade normal flankvävnad. Inga skillnader observerades i de elektriskt stressade vävnaderna jämfört med kontrollvävnaden, trots att spänningen ökade till 50 V. Inga avvikelser observerades 24 timmar efter elektrisk stimulering. Både inflammatoriska och apoptotiska effekter av den elektriska stimuleringen undersöktes genom dubbel immunofluorescensfärgning för caspase-3 och COX-2. Figur 4 visar resultaten av dubbel immunofluorescensfärgning för normala (icke-stimulerade) och stimulerade (vid 10 och 50 V) vävnader. Det fanns inget uttryck för inflammation eller apoptos i vävnaderna omedelbart efter elektrisk stimulering eller efter en dag, vilket bekräftar att elektrisk stimulering endast orsakade smärta och inte vävnadsskador.
3.3. Tryckdolorimeter
Råttans högra bakfot behandlades med carrageenan för att framkalla inflammation, och bakfoten fotograferades från övre och laterala vyer, vilket visas i figur 5. En grupp behandlades inte med carrageenan som kontroll och den andra gruppen behandlades med saltlösning som negativ kontroll (figur 5(a)). 1 % karrageenan injicerades i varierande mängder på 100 μl, 150 μl och 200 μl. De inflammatoriska symtomen ödem och rodnad observerades i alla baktassar som behandlades med karrageenan, medan kontroll- och saltlösningsbehandlade grupper inte uppvisade några symtom. Den inflammatoriska effekten av karrageenan framkom tydligt genom H&E-färgning. Som framgår av figur 5(b) uppvisade de kontroll- och saltvattenbehandlade grupperna ett friskt vävnadstillstånd. En ansamling av infiltrerade inflammatoriska celler observerades dock i alla carrageenan-behandlade grupper, vilket indikeras med pilar. Den högra bilden är en höger baktass av en råtta som användes för kontroll, saltlösning och carrageenan och den vänstra bilden är en vänster baktass av råttan i figur 5(b).
Under inflammationsförloppet mättes både volymen och storleken (bredd × höjd) på baktassan med hjälp av plethysmometri och kalibrar. Mätningen genomfördes omedelbart efter injektionen av saltlösning och karrageenan och fortsatte sedan i åtta timmar. I alla karragenanbehandlade grupper ökade både volymen och storleken på baktassarna successivt med tiden upp till 6 timmar, men ödemet minskade med ytterligare ökad tid (figurerna 6 a och 6 b). Kontrollgrupperna och de salinbehandlade grupperna uppvisade inga förändringar i volym och storlek. Efter att ha mätt ödem (figurerna 6(a) och 6(b)) baserat på koncentrationen av carrageenaninjektionen bekräftade vi råttans verkningsaspekt (tryck) i det maximala ödemtillståndet 6 timmar efter carrageenaninjektionen (figur 6(c)). Denna mätning utfördes för att samla in en mängd information om det kliniska inflammationstillståndet. I kontroll- och saltlösningsgrupperna visade tryckmätningsresultaten inga signifikanta förändringar. I gruppen med karrageenaninducerat tassödem kunde vi urskilja skillnader i tryckvärden beroende på den observerade inflammationen. Dessa resultat tyder på att vi kunde fastställa graden av smärta enligt olika inflammationsnivåer. I den här studien användes carrageenan för att utvärdera akut inflammation; bedömning av kronisk inflammation kommer att utvärderas med hjälp av Complete Freund’s Adjuvant.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Slutsatser
Vi utvecklade ett smärtmätningssystem för objektiv och kvantitativ smärtbedömning. För korsvalidering bestod systemet av både elektrisk stimulering och tryckkomponenter. Innan systemet tillämpades i en klinisk miljö bekräftades systemets säkerhet och tillförlitlighet med hjälp av en djurmodell. Den elektriska stimuleringen orsakade inga skador, inklusive vävnadsinflammation och apoptos. I trycktestet var de uppmätta tryckvärdena beroende av graden av inflammation. Vårt smärtmätningssystem kräver en kort mättid och framkallade ingen inflammation när det applicerades på råttvävnad. För närvarande har vår forskning och utveckling slutförts och är redo för kommersialisering. Den mest använda delen kommer att vara nociceptiv smärta. Den används på rehabiliteringsmedicinska avdelningen, och neurokirurgisk smärta (neuropatisk smärta) kommer att tillämpas i framtiden. Även om många utmaningar kvarstår kan detta smärtmätningssystem ge spännande möjligheter för diagnos och behandling av olika sjukdomar.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ”Software Convergence Technology Development Program”, genom ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering (ITAS017716011029000101000200200) och ministeriet för handel, industri och energi (MOTIE), Korea, genom utbildningsprogrammet för kreativ och industriell konvergens (Grant no. N0000717) och National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansierat av den koreanska regeringens ministerium för utbildning, vetenskap och teknik (nr. 2011-0030072).
Supplementary Materials
Supplementary data associated with this article can be found in the online version. Figur S1: Tryckdolorimeter av handtyp med trycksensor och displaykomponenter. Figur S2: En bild som visar tidsförloppet av karrageenaninducerat tassarödem efter en injektionsvolym på 100 μl. Figur S3: En bild som visar tidsförloppet av karrageenaninducerat tassarödem efter en injektionsvolym på 150 μl. Figur S4: En bild som visar tidsförloppet för karrageenaninducerat tassarödem efter en injektionsvolym på 200 μl. (Kompletterande material)