Abstract
La comprensione e la valutazione precisa del livello di dolore sono fattori chiave nella terapia di riabilitazione. Il dolore è un’esperienza complessa e soggettiva che è influenzata dalle emozioni e dalle condizioni di salute di un individuo. Sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione quantitativa del livello di dolore; tuttavia, questi metodi hanno diversi svantaggi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un dispositivo di misurazione del dolore per la valutazione quantitativa del dolore. Il sistema consiste di due parti, un componente per la stimolazione elettrica e un dolorimetro a pressione, per l’applicazione di due diverse sollecitazioni. Per quanto riguarda la stimolazione elettrica, il grado di dolore è valutato dalla corrente applicata. Anche la resistenza della pelle è stata analizzata applicando la corrente per eliminare gli effetti causati dalle condizioni della pelle. La stimolazione elettrica non ha indotto alcun cambiamento istologico o infiammazione nei tessuti. Utilizzando il dolorimetro a pressione, il livello di dolore è stato valutato in base al grado di infiammazione. Questo sistema potrebbe essere utilizzato per la valutazione quantitativa del dolore indotto da infiammazioni, ferite e altri fattori. Poiché il sistema descritto è il primo del suo genere, ci sono molti problemi che rimangono da risolvere. Tuttavia, con il continuo sviluppo, il nostro sistema potrebbe fornire una valutazione del dolore più accurata rimuovendo gli effetti delle condizioni della pelle e attraverso la convalida incrociata.
1. Introduzione
La valutazione della scala del dolore di un paziente è una questione importante durante la riabilitazione. Tuttavia, la misurazione del dolore è difficile perché è una sensazione complessa associata a caratteristiche ed esperienze personali. Sono stati sviluppati vari metodi per valutare la scala del dolore, tra cui Visual Analog Scale (VAS), Numerical Rating Scale (NRS), Verbal Rating Scale (VRS), FACES Pain Rating Scale (FPRS), e McGill Pain Questionnaire (MPQ). Tra questi, VAS e FPRS sono stati principalmente utilizzati in ambito clinico. La VAS è progettata come una linea retta di lunghezza fissa, 10 centimetri. Le estremità sono definite come i limiti estremi del parametro da misurare, orientati da “nessun dolore” al “peggior dolore immaginabile”. I pazienti segnano sulla linea corrispondente all’intensità del dolore che provano attualmente. La NRS istruisce i pazienti a scegliere un numero da 0 a 10 che meglio descrive la loro attuale intensità del dolore. 0 significa “nessun dolore” e 10 significa “il peggior dolore possibile”. Il VRS è un metodo di valutazione del dolore che è espresso in parole invece che in numeri. I pazienti scelgono una frase come nessun dolore, dolore moderato, dolore grave, dolore molto grave, e peggior dolore possibile per descrivere la loro sensazione di dolore. La FPRS è una scala del dolore a sei punti con sei diverse facce che rappresentano livelli di dolore crescenti. Ai pazienti viene chiesto di selezionare l’espressione che meglio caratterizza l’intensità del dolore, da “nessun dolore” a “dolore grave”. Tutti questi metodi sono soggettivi e dipendono dall’esperienza personale e dalle emozioni. Pertanto, ci sono notevoli variazioni individuali nel dolore valutato che risultano in una difficile valutazione quantitativa.
Recentemente, è stato introdotto un metodo quantitativo di valutazione del dolore che utilizza la stimolazione elettrica. I dispositivi PainVision™ misurano la soglia di percezione e il dolore prodotto da una corrente elettrica. Questo sistema quantifica l’intensità del dolore confrontando il dolore sperimentato con l’intensità delle percezioni elettriche. La soglia di percezione indica la minima corrente elettrica percepita dall’individuo, e il dolore prodotto è definito come la massima corrente elettrica percepita dall’individuo. Tuttavia, la resistenza della pelle di un individuo può influenzare il risultato della misurazione elettrica.
I fattori più importanti nello sviluppo di un dispositivo di misurazione del dolore sono l’obiettività, la precisione e la valutazione quantitativa. PainVision è un sistema che permette ai pazienti di effettuare misurazioni indipendentemente dalla resistenza della pelle. La resistenza della pelle varia con le condizioni e l’ambiente del paziente. È difficile spiegare la correlazione con le misurazioni precedenti se il dolore viene misurato trascurando la resistenza della pelle. Ma, il nostro sistema misura dalla resistenza cutanea del paziente prima di misurare il dolore.
Dopo aver determinato il valore della resistenza cutanea di base del paziente, si misura il dolore. Cioè, il valore di resistenza della pelle è uno standard. Quando il valore di riferimento è preparato, una descrizione della correlazione dei valori del dolore misurati prima e dopo la misurazione del dolore diventa possibile.
In questo lavoro, abbiamo sviluppato un dispositivo di misurazione del dolore che ha due metodi di analisi, la stimolazione elettrica e l’applicazione della pressione, per una valutazione di validazione incrociata più accurata. Durante la stimolazione elettrica, lo stress elettrico viene applicato su un sito non doloroso e poi lo stress osservato può essere paragonato al dolore. I tessuti sollecitati elettricamente sono stati esaminati istologicamente per identificare se la stimolazione elettrica ha causato danni ai tessuti. Durante la valutazione della pressione, il dolore è stato valutato applicando una pressione sul sito del dolore. L’infiammazione è stata indotta sulla zampa posteriore del ratto dalla carragenina, e poi la zampa posteriore infiammata è stata stimolata da uno stimolatore di pressione di tipo manuale. Il sito di pressione è stato poi confrontato con i livelli di infiammazione.
2. Materiale e metodi
2.1. Principio e componenti del dispositivo di misurazione del dolore
Il dispositivo di misurazione del dolore è stato sviluppato per l’analisi quantitativa del dolore. Il dispositivo è composto da due parti principali che includono un componente per la stimolazione elettrica e un dolorimetro a pressione, come mostrato nella Figura 1. La stimolazione può essere applicata separatamente all’individuo sia elettricamente che tramite pressione. Confrontando la risposta alla stimolazione elettrica e alla pressione, potremmo ottenere risultati più accurati. Durante la stimolazione elettrica, il dolore sperimentato dai pazienti è sostituito dalla stimolazione elettrica; in particolare, il valore di corrente applicato è tradotto in un valore di dolore sperimentato o sperimentabile. Inoltre, valutando la stimolazione elettrica e la resistenza della pelle allo stesso tempo, ci aspettiamo di valutare oggettivamente il dolore nonostante le condizioni variabili come i cambiamenti della pelle e del corpo, il tempo o le condizioni ambientali. Mentre si usa il dolorimetro a pressione, la pressione viene applicata direttamente al sito del dolore e l’insorgenza del dolore viene misurata dalla quantità di pressione.
Il dispositivo di misurazione del dolore utilizza cinque pulsanti tra cui l’alimentazione, ES (stimolazione elettrica), PS (stimolazione a pressione), EB (pulsante di emergenza), e SS (interruttore di arresto). ES e PS sono utilizzati per applicare la stimolazione elettrica e la pressione all’individuo. EB è un pulsante di spegnimento disponibile in caso di emergenza, e SS è un pulsante utilizzato alla fine delle misurazioni del dolore. Il componente di stimolazione elettrica è stato collegato con due elettrodi per misurare la corrente percepita (50 Hz, larghezza dell’impulso 0,3 ms) e la soglia del dolore. I due elettrodi sono posizionati su un sito piatto, come il fianco di un animale o l’avambraccio mediale di un uomo. Il sistema di stimolazione elettrica fornisce lo stesso livello di stimolazione e intensità di stimolo del dolore; la fibra Ad conduce principalmente il segnale del dolore (segnale elettrico). Il dolorimetro a pressione è collegato a un sensore di pressione a punta di uno stimolatore della mano. L’interruttore di stop è stato premuto quando il partecipante ha sentito dolore.
2.2. Preparazione del modello animale
Ratti Sprague-Dawley maschi adulti (Raon Bio. Inc., Yongin, Corea) del peso di 250-350 g e dell’età di 49-56 giorni sono stati tenuti sotto un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio (luci alle 06:00 h) a 24 ± 0,5°C in una struttura centrale di cura degli animali. Acqua e cibo per ratti sono stati forniti ad libitum fino all’inizio degli esperimenti. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per gli esperimenti sugli animali del College of Medicine, Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-084), e sono stati trattati in stretta conformità con il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
2.3. Esame istologico
I ratti sono stati stimolati elettricamente o trattati con carragenina per indurre il dolore. Le risposte infiammatorie indotte dai due diversi trattamenti sono state confrontate con la valutazione istologica. I ratti sono stati perfusi intracardicamente con PBS freddo contenente eparina (0,2 U/ml) e paraformaldeide 4% e poi stoccati in paraformaldeide 4%. I tessuti stressati risultanti dalla stimolazione elettrica e dalla carragenina sono stati bisecati e posti in cassette per l’embedding. Ogni campione è stato incorporato in cera di paraffina e poi sezionato in campioni di 5 μm di spessore utilizzando un microtomo rotante (HM340E, Microm, Walldorf, Germania). Il campione sezionato è stato colorato con ematossilina ed eosina (H&E) e poi analizzato con un microscopio di ricerca invertito Nikon Ti-E e una fotocamera digitale Nikon Ds-Ri1 controllata dal software Nis-Elements (Br) (Nikon Inc., Kawasaki, Giappone).
2.4. Colorazione in immunofluorescenza
Gli effetti della stimolazione elettrica sull’infiammazione e l’apoptosi dei tessuti sono stati studiati in immunofluorescenza. Il tessuto del fianco dei ratti stimolato elettricamente è stato incorporato in paraffina e sezionato in campioni di 4 μm di spessore. Per il recupero dell’antigene, le sezioni di tessuto sono state riscaldate in tampone TRS per circa dieci minuti e poi lavate con acqua distillata per tre volte. I campioni sono stati trattati con lo 0,03% di H2O2 per l’inibizione dell’attività della perossidasi endogena e poi lavati con la soluzione PBS. Poi i campioni sono stati permeabilizzati con 0,5% Triton X-100 in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente e bloccati con 5% capra e 1% sieroalbumina bovina in PBS per un’ora. I campioni sono stati lavati con PBS due volte per dieci minuti ciascuno. I campioni sono stati incubati una notte a 4°C con un anticorpo primario, COX2 (diluito 1 : 1000) o caspasi-3 (diluito 1 : 1000), diluito in 1% sieroalbumina bovina in PBS. I campioni sono stati lavati quattro volte con PBS e poi incubati in ordine cronologico con un anticorpo secondario (topo e coniglio, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) diluito in 1% BSA in PBS a temperatura ambiente al buio per due ore. Infine, i campioni sono stati lavati due volte con PBS per due minuti e poi coperti con mezzo di montaggio contenente DAPI. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Zeiss Axiovert (Zeiss, Germania) e un sistema di analisi Axiovision Rel. 4.5 (Zeiss, Germania).
3. Risultati e discussione
3.1. Schema di misurazione del dolore
Per la stimolazione elettrica, i ratti sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale con cloralio idrato (300 mg/kg), e il pelo del ratto è stato rimosso. L’elettrodo ECG è stato attaccato al fianco destro del ratto per la stimolazione elettrica, come mostrato nella Figura 2(a). La stimolazione elettrica è stata applicata al fianco sinistro del ratto. La tensione applicata è stata gradualmente aumentata da 0 a 50 V. Il valore di corrente misurata in ogni ratto variava da 12,5 a 92 μA come mostrato nella Figura 2 (b). Il comportamento di risposta del ratto non è stato osservato perché la stimolazione elettrica è stata condotta sotto anestesia. Tuttavia, ci aspettiamo che la stimolazione può sempre essere misurata indipendentemente dalla condizione fisica o pelle identificando la tensione, corrente e resistenza relativi ai fattori fisiologici del ratto.
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Nel test del dolorimetro a pressione, il ratto è stato messo in una camera di contenimento senza anestetico, come mostrato nella figura 2(c). L’infiammazione è stata indotta dall’iniezione di carragenina nella zampa posteriore destra. La carragenina è stata usata per confermare il dolore nocicettivo. L’attrezzatura che abbiamo costruito è stata fatta anche per identificare prima il dolore nocicettivo. I livelli di infiammazione sono stati controllati dalla quantità di carragenina, che è stata aumentata da 100 a 200 μl di una soluzione all’1% (w/v). 100 μl di soluzione salina sono stati iniettati nella regione intraplantare della zampa posteriore sinistra come controllo. La zampa posteriore destra infiammata è stata stimolata da uno stimolatore di pressione di tipo manuale, come mostrato nella Figura S1. Il ratto ha risposto alla stimolazione a pressione. La nostra ipotesi è che la soglia della risposta alla pressione nel ratto dipende dal grado di infiammazione. L’espressione dell’infiammazione nella zampa posteriore del ratto imita i livelli di malattia nella pratica clinica. Gli aumenti del volume e delle dimensioni della zampa posteriore in base all’infiammazione sono stati misurati ad ogni punto temporale dopo l’iniezione di carragenina. I volumi delle zampe posteriori sono stati misurati con la pletismometria (pletismometro modello 7140, Ugo Basile, Italia), e i calibri (modello CD-6P; Mitutoyo, Tokyo, Giappone) sono stati usati per misurare la larghezza e lo spessore delle zampe di ogni ratto. La stimolazione della pressione è stata applicata quando l’espressione dell’infiammazione ha raggiunto il massimo. La risposta del ratto è stata osservata aumentando il livello di pressione, e la soglia di pressione è stata confrontata con il grado di infiammazione.
3.2. Stimolazione elettrica
Per verificare che la stimolazione elettrica applicata inducesse solo dolore senza danni al ratto, i tessuti stimolati sono stati esaminati in termini di istologia e infiammazione. La figura 3 mostra le immagini macroscopiche dei tessuti colorati con H&E che sono stati stimolati elettricamente aumentando la tensione da 0 a 50 V. Un gruppo di tessuti è stato colorato immediatamente dopo la stimolazione elettrica (colonna sinistra), e l’altro è stato colorato un giorno dopo la stimolazione (colonna destra).
Il gruppo di controllo ha mostrato il tessuto della pancia normale. Nessuna differenza è stata osservata nei tessuti sollecitati elettricamente rispetto al tessuto di controllo, anche se la tensione è aumentata a 50 V. Nessuna anomalia è stata osservata 24 ore dopo la stimolazione elettrica. Entrambi gli effetti infiammatori e apoptotici della stimolazione elettrica sono stati esaminati mediante colorazione a doppia immunofluorescenza per caspasi-3 e COX-2. La Figura 4 mostra i risultati della doppia colorazione di immunofluorescenza per i tessuti normali (non stimolati) e stimolati (a 10 e 50 V). Non c’era espressione di infiammazione o apoptosi nei tessuti immediatamente dopo la stimolazione elettrica o dopo un giorno, confermando che la stimolazione elettrica ha causato solo dolore e non ha indotto danni ai tessuti.
3.3. Dolorimetro a pressione
La zampa posteriore destra del ratto è stata trattata con carragenina per indurre l’infiammazione, e la zampa posteriore è stata fotografata dalla vista superiore e laterale, come mostrato nella Figura 5. Un gruppo non è stato trattato con carragenina come controllo, e l’altro è stato trattato con soluzione salina come controllo negativo (Figura 5(a)). 1% carragenina è stato iniettato in quantità variabili di 100 microlitri, 150 microlitri, e 200 microlitri. I sintomi infiammatori di edema e arrossamento sono stati osservati in tutte le zampe posteriori trattati da carragenina, mentre il controllo e la soluzione salina gruppi trattati non ha mostrato sintomi. L’effetto infiammatorio della carragenina è stato chiaramente rivelato dalla colorazione H&E. Come mostrato nella Figura 5(b), i gruppi di controllo e trattati con soluzione salina hanno mostrato uno stato di tessuto sano. Tuttavia, l’accumulo di cellule infiammatorie infiltrate è stato osservato in tutti i gruppi trattati con carragenina, come indicato dalle frecce. L’immagine di destra è una zampa posteriore destra di un ratto utilizzato per il controllo, la soluzione salina, e carragenina, e l’immagine di sinistra è una zampa posteriore sinistra del ratto in Figura 5 (b).
Durante il progresso dell’infiammazione, sia il volume che le dimensioni (larghezza × altezza) della zampa posteriore sono stati misurati usando pletismometria e calibri. La misurazione è stata condotta immediatamente dopo l’iniezione di soluzione salina e carragenina e poi continuata per otto ore. In tutti i gruppi trattati con carragenina, sia il volume che le dimensioni delle zampe posteriori sono aumentati progressivamente con il tempo fino a 6 ore; tuttavia, l’edema è diminuito con l’ulteriore aumento del tempo (Figure 6(a) e 6(b)). I gruppi di controllo e trattati con soluzione salina non hanno mostrato cambiamenti nel volume e nelle dimensioni. Dopo aver misurato l’edema (Figure 6(a) e 6(b)) in base alla concentrazione dell’iniezione di carragenina, abbiamo confermato l’aspetto dell’azione del ratto (pressione) nello stato massimo di edema 6 h dopo l’iniezione di carragenina (Figura 6(c)). Questa misurazione è stata eseguita per raccogliere una serie di informazioni sullo stato di infiammazione clinica. Nei gruppi di controllo e salina, i risultati del test di pressione non hanno mostrato cambiamenti significativi. Nel gruppo dell’edema della zampa indotto da carragenina, siamo stati in grado di distinguere le differenze nei valori di pressione a seconda dell’infiammazione osservata. Questi risultati indicano che potremmo determinare il grado di dolore in base ai vari livelli di infiammazione. In questo studio, la carragenina è stata utilizzata per valutare l’infiammazione acuta; la valutazione dell’infiammazione cronica sarà valutata utilizzando l’adiuvante di Freund completo.
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4. Conclusioni
Abbiamo sviluppato un sistema di misurazione del dolore per una valutazione oggettiva e quantitativa del dolore. Per la convalida incrociata, il sistema consisteva di componenti di stimolazione elettrica e di pressione. Prima di applicare questo sistema in un contesto clinico, la sicurezza e l’affidabilità del sistema sono state confermate utilizzando un modello animale. La stimolazione elettrica non ha causato alcun danno, compresa l’infiammazione dei tessuti e l’apoptosi. Nel test della pressione, i valori di pressione misurati dipendevano dal grado di infiammazione. Il nostro sistema di misurazione del dolore richiede un breve tempo di misurazione e non ha indotto infiammazioni quando è stato applicato al tessuto del ratto. Attualmente, la nostra ricerca e sviluppo è stata completata e pronta per la commercializzazione. La parte più comunemente usata sarà il dolore nocicettivo. È usato nel dipartimento di medicina della riabilitazione, e il dolore neurochirurgico (dolore neuropatico) sarà applicato in futuro. Anche se rimangono molte sfide, questo sistema di misurazione del dolore può fornire opportunità interessanti per la diagnosi e il trattamento di varie malattie.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Riconoscimenti
Questa ricerca è stata supportata dal “Software Convergence Technology Development Program,” attraverso il Ministero della Scienza, ICT e Pianificazione Futura (ITAS0177160110290001000200200) e il Ministero del Commercio, Industria ed Energia (MOTIE), Corea, attraverso l’Education Program for Creative and Industrial Convergence (Grant no. N0000717) e National Research Foundation of Korea (NRF) sovvenzione finanziata dal Ministero dell’Istruzione, della Scienza e della Tecnologia del governo coreano (n. 2011-0030072).
Materiale supplementare
I dati supplementari associati a questo articolo possono essere trovati nella versione online. Figura S1: il dolorimetro a mano con sensore di pressione e componenti del display. Figura S2: un’immagine che mostra il corso del tempo di carragenina indotta edema della zampa dopo un volume di iniezione 100 μl. Figura S3: un’immagine che mostra l’andamento temporale dell’edema della zampa indotto dalla carragenina dopo un volume di iniezione di 150 μl. Figura S4: un’immagine che mostra il corso del tempo di carragenina indotta edema della zampa dopo un volume di iniezione 200 microlitri. (Materiali supplementari)
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