Abstract
Pochopení a přesné posouzení úrovně bolesti jsou klíčovými faktory v rehabilitační terapii. Bolest je komplexní a subjektivní zážitek, který je ovlivněn emocemi a zdravotním stavem jedince. Pro kvantitativní hodnocení úrovně bolesti byly vyvinuty různé metody, které však mají několik nevýhod. V této práci jsme vyvinuli zařízení pro kvantitativní hodnocení bolesti. Systém se skládá ze dvou částí, součásti pro elektrickou stimulaci a tlakového dolorimetru, pro aplikaci dvou různých zátěží. Pokud jde o elektrickou stimulaci, stupeň bolesti se hodnotí podle aplikovaného proudu. Pomocí aplikace proudu byl také analyzován kožní odpor, aby se odstranily účinky způsobené stavem kůže. Elektrická stimulace nevyvolala ve tkáních žádné histologické změny ani zánět. Pomocí tlakového dolorimetru byla hodnocena míra bolesti podle stupně zánětu. Tento systém by mohl být použit pro kvantitativní hodnocení bolesti vyvolané zánětem, poraněním a dalšími faktory. Vzhledem k tomu, že popsaný systém je první svého druhu, zbývá vyřešit ještě mnoho problémů. S pokračujícím vývojem by však náš systém mohl poskytovat přesnější hodnocení bolesti díky odstranění vlivu stavu kůže a díky křížovému ověřování.
1. Úvod
Vyhodnocení rozsahu bolesti pacienta je důležitou otázkou během rehabilitace. Měření bolesti je však obtížné, protože se jedná o komplexní pocit spojený s osobními charakteristikami a zkušenostmi . K hodnocení škály bolesti byly vyvinuty různé metody, včetně vizuální analogové škály (VAS), numerické hodnotící škály (NRS), slovní hodnotící škály (VRS), škály hodnocení bolesti FACES (FPRS) a McGillova dotazníku bolesti (MPQ) . Z nich se v klinických podmínkách používají především VAS a FPRS . VAS je navržen jako přímka o pevné délce 10 cm. Konce jsou definovány jako krajní meze měřeného parametru orientované od „žádné bolesti“ po „nejhorší představitelnou bolest“. Pacienti označují na čáře odpovídající intenzitě bolesti, kterou aktuálně pociťují. NRS instruuje pacienty, aby zvolili číslo od 0 do 10, které nejlépe vystihuje jejich aktuální intenzitu bolesti. 0 znamená „žádná bolest“ a 10 znamená „nejhorší možná bolest“. VRS je metoda hodnocení bolesti, která je vyjádřena slovy namísto čísel. Pacienti volí věty, jako je žádná bolest, mírná bolest, silná bolest, velmi silná bolest a nejhorší možná bolest, které popisují jejich pocit bolesti. FPRS je šestibodová škála bolesti se šesti různými stěnami, které představují zvyšující se úroveň bolesti. Pacienti mají vybrat výraz, který nejlépe charakterizuje intenzitu bolesti, od „žádná bolest“ po „silná bolest“. Všechny tyto metody jsou subjektivní a závisí na osobní zkušenosti a emocích. Proto existují značné individuální rozdíly v hodnocené bolesti, které vedou k obtížnému kvantitativnímu hodnocení.
Nedávno byla zavedena metoda kvantitativního hodnocení bolesti pomocí elektrické stimulace . Přístroje PainVision™ měří práh vnímání a bolest vyvolanou elektrickým proudem. Tento systém kvantifikuje intenzitu bolesti porovnáním prožívané bolesti s intenzitou elektrických vjemů. Práh vnímání udává minimální elektrický proud vnímaný jedincem a vyvolaná bolest je definována jako maximální elektrický proud vnímaný jedincem. Kožní odpor jedince však může ovlivnit výsledek elektrického měření .
Nejdůležitějšími faktory při vývoji zařízení pro měření bolesti jsou objektivita, přesnost a kvantitativní hodnocení. PainVision je systém, který umožňuje pacientům provádět měření bez ohledu na kožní odpor. Kožní odpor se mění v závislosti na stavu a prostředí pacienta. Je obtížné vysvětlit korelaci s předchozími měřeními, pokud je bolest měřena se zanedbáním kožního odporu. Náš systém však před měřením bolesti měří z kožního odporu pacienta.
Po stanovení výchozí hodnoty kožního odporu pacienta se měří bolest. To znamená, že hodnota kožního odporu je standardem. Když je referenční hodnota připravena, je možné popsat korelaci hodnot bolesti naměřených před a po měření bolesti.
V této práci jsme vyvinuli zařízení pro měření bolesti, které má dvě metody analýzy, elektrickou stimulaci a vyvíjení tlaku, pro přesnější křížové hodnocení. Při elektrické stimulaci se aplikuje elektrické napětí na místo, které nebolí, a poté lze pozorované napětí porovnat s bolestí. Elektricky namáhané tkáně byly histologicky vyšetřeny, aby se zjistilo, zda elektrická stimulace způsobila poškození tkáně. Během hodnocení tlaku byla hodnocena bolest působením tlaku na bolestivé místo. Na zadní tlapce potkana byl vyvolán zánět pomocí karagenanu a poté byla zanícená zadní tlapka stimulována ručním tlakovým stimulátorem. Místo tlaku bylo poté porovnáno s úrovní zánětu.
2. Materiál a metody
2.1. Materiál a metody
2.2. Materiál a metody
2.3. Materiál a metody Princip a součásti zařízení pro měření bolesti
2.3. Materiál a metody Princip a součásti zařízení pro měření bolesti
Zařízení pro měření bolesti bylo vyvinuto pro kvantitativní analýzu bolesti. Zařízení se skládá ze dvou hlavních částí včetně součásti pro elektrickou stimulaci a tlakového dolorimetru, jak je znázorněno na obrázku 1. Stimulace mohla být na jedince aplikována samostatně buď elektricky, nebo tlakem. Porovnáním odezvy na elektrickou stimulaci a tlak jsme mohli získat přesnější výsledky. Při elektrické stimulaci je bolest pociťovaná pacienty nahrazena elektrickou stimulací; konkrétně je hodnota aplikovaného proudu převedena na hodnotu pociťované nebo prožívané bolesti. Také díky současnému vyhodnocování elektrické stimulace a kožního odporu očekáváme objektivní vyhodnocení bolesti navzdory měnícím se podmínkám, jako jsou změny na kůži a těle, počasí nebo podmínky prostředí. Při použití tlakového dolorimetru se tlak aplikuje přímo na místo bolesti a nástup bolesti se měří podle velikosti tlaku.
Zařízení pro měření bolesti využívá pět tlačítek včetně tlačítka napájení, ES (elektrická stimulace), PS (tlaková stimulace), EB (nouzové tlačítko) a SS (stopspínač). ES a PS se používají k aplikaci elektrické a tlakové stimulace na jednotlivce. EB je tlačítko pro vypnutí napájení, které je k dispozici v případě nouze, a SS je tlačítko používané na konci měření bolesti. Součást elektrické stimulace byla připojena dvěma elektrodami pro měření vnímaného proudu (50 Hz, šířka impulzu 0,3 ms) a prahu bolesti. Obě elektrody se umístí na ploché místo, jako je bok zvířete nebo mediální předloktí člověka. Systém elektrické stimulace poskytuje stejnou úroveň stimulace a intenzitu podnětu jako bolest; Ad-vlákno vede primárně signál bolesti (elektrický signál). Tlakový dolorimetr je připojen k hrotovému snímači tlaku ručního stimulátoru. Spínač stop byl stisknut, když účastník pocítil bolest.
2.2. Spínač stop byl stisknut, když účastník pocítil bolest. Příprava zvířecího modelu
Dospělí samci potkanů Sprague-Dawley (Raon Bio. Inc., Yongin, Korea) o hmotnosti 250-350 g a stáří 49-56 dní byli chováni v cyklu 12 h světlo/12 h tma (světla v 06:00 h) při teplotě 24 ± 0,5 °C v centrálním zařízení pro péči o zvířata. Voda a krmivo pro potkany byly poskytovány ad libitum až do zahájení pokusů. Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro pokusy na zvířatech na Lékařské fakultě Univerzity Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-084) a bylo s nimi zacházeno v přísném souladu s Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat Národního institutu zdraví (National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)
2.3. Histologické vyšetření
Potkani byli buď elektricky stimulováni, nebo ošetřeni karagenanem k vyvolání bolesti. Zánětlivé reakce vyvolané oběma různými způsoby ošetření byly porovnány pomocí histologického hodnocení. Potkani byli intrakardiálně perfundováni studeným PBS obsahujícím heparin (0,2 U/ml) a 4% paraformaldehyd a následně uskladněni ve 4% paraformaldehydu. Stresované tkáně vzniklé elektrickou stimulací a stimulací karagenanem byly rozřezány a uloženy do kazet pro embedování. Každý vzorek byl zalit do parafínu a poté rozřezán na 5 μm silné řezy pomocí rotačního mikrotomu (HM340E, Microm, Walldorf, Německo). Rozřezaný vzorek byl obarven hematoxylinem a eosinem (H&E) a poté analyzován pod inverzním výzkumným mikroskopem Ti-E společnosti Nikon a digitálním fotoaparátem Nikon Ds-Ri1 řízeným softwarem Nis-Elements (Br) (Nikon Inc., Kawasaki, Japonsko).
2.4. Imunofluorescenční barvení
Účinky elektrické stimulace na zánět a apoptózu tkání byly zkoumány pomocí imunofluorescence. Elektricky stimulovaná tkáň boku potkanů byla zalita do parafínu a rozřezána na vzorky o tloušťce 4 μm. Pro získání antigenu byly řezy tkání zahřívány v TRS pufru po dobu přibližně deseti minut a poté třikrát promyty destilovanou vodou. Vzorky byly ošetřeny 0,03% H2O2 pro inhibici aktivity endogenní peroxidázy a poté promyty roztokem PBS. Poté byly vzorky permeabilizovány 0,5% Tritonem X-100 v PBS po dobu deseti minut při pokojové teplotě a blokovány 5% kozím a 1% hovězím sérovým albuminem v PBS po dobu jedné hodiny. Vzorky byly dvakrát promyty roztokem PBS vždy po dobu deseti minut. Vzorky byly inkubovány přes noc při 4 °C s primární protilátkou, buď COX2 (zředěnou 1 : 1000), nebo kaspázou-3 (zředěnou 1 : 1000), zředěnou v 1% bovinním sérovém albuminu v PBS. Vzorky byly čtyřikrát promyty PBS a poté inkubovány v chronologickém pořadí se sekundární protilátkou (myší a králičí, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) zředěnou v 1% BSA v PBS při pokojové teplotě ve tmě po dobu dvou hodin. Nakonec byly vzorky dvakrát promyty PBS po dobu dvou minut a poté překryty montážním médiem obsahujícím DAPI. Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Zeiss Axiovert (Zeiss, Německo) a analytického systému Axiovision Rel. 4.5 (Zeiss, Německo).
3. Výsledky a diskuse
3.1. Výsledky a diskuse
3.1. Výsledky a diskuse Schéma měření bolesti
Pro elektrickou stimulaci byli potkani anestetizováni intraperitoneální injekcí chloralhydrátu (300 mg/kg) a byla jim odstraněna srst. K pravému boku potkana byla připojena EKG elektroda pro elektrickou stimulaci, jak je znázorněno na obrázku 2(a). Elektrická stimulace byla aplikována na levý bok potkana. Aplikované napětí se postupně zvyšovalo od 0 do 50 V. Hodnota proudu naměřená u každého potkana se pohybovala od 12,5 do 92 μA, jak je znázorněno na obrázku 2b. Reakční chování potkana nebylo pozorováno, protože elektrická stimulace byla prováděna v anestezii. Očekáváme však, že stimulaci lze vždy měřit bez ohledu na fyzický stav nebo stav kůže pomocí identifikace napětí, proudu a odporu souvisejícího s fyziologickými faktory potkana.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Při testu tlakovým dolorimetrem byl potkan umístěn do znehybňovací komory bez anestetika, jak je znázorněno na obrázku 2(c). Zánět byl vyvolán injekcí karagenanu do pravé zadní tlapy. Karagenan byl použit k potvrzení nociceptivní bolesti. Námi sestrojené zařízení bylo také vyrobeno tak, aby nejprve identifikovalo nociceptivní bolest. Úroveň zánětu byla kontrolována množstvím karagenanu, které bylo zvýšeno ze 100 na 200 μl 1% (w/v) roztoku. Jako kontrola bylo do intraplantární oblasti levé zadní tlapy vstříknuto 100 μl fyziologického roztoku. Zanícená pravá zadní tlapa byla stimulována ručním tlakovým stimulátorem, jak je znázorněno na obrázku S1. Potkan na tlakovou stimulaci reagoval. Naší hypotézou je, že práh tlakové odpovědi u potkana závisí na stupni zánětu. Exprese zánětu v zadní tlapě potkana napodobuje úroveň onemocnění v klinické praxi. Zvětšení objemu a velikosti zadní tlapy v závislosti na zánětu bylo měřeno v každém časovém bodě po injekci karagenanu. Objemy zadních tlapek byly měřeny pletysmometrem (model 7140 pletysmometr, Ugo Basile, Itálie) a k měření šířky a tloušťky tlapek každého potkana byly použity kalipery (model CD-6P; Mitutoyo, Tokio, Japonsko). Tlaková stimulace byla použita, když projevy zánětu dosáhly maxima. Reakce potkanů byla sledována zvyšováním úrovně tlaku a práh tlaku byl porovnáván se stupněm zánětu.
3.2. Elektrická stimulace
Pro ověření, že aplikovaná elektrická stimulace vyvolala pouze bolest bez poškození potkana, byly stimulované tkáně vyšetřeny z hlediska histologie a zánětu. Obrázek 3 ukazuje makroskopické snímky tkání obarvených H&E, které byly elektricky stimulovány zvyšujícím se napětím od 0 do 50 V. Jedna skupina tkání byla obarvena bezprostředně po elektrické stimulaci (levý sloupec) a druhá den po stimulaci (pravý sloupec).
Kontrolní skupina vykazovala normální tkáň boku. U elektricky namáhaných tkání nebyly pozorovány žádné rozdíly ve srovnání s kontrolní tkání, i když se napětí zvýšilo na 50 V. Po 24 hodinách od elektrické stimulace nebyly pozorovány žádné abnormality. Zánětlivé i apoptotické účinky elektrické stimulace byly zkoumány pomocí dvojitého imunofluorescenčního barvení na kaspázu-3 a COX-2. Obrázek 4 ukazuje výsledky dvojitého imunofluorescenčního barvení pro normální (nestimulované) a stimulované (při 10 a 50 V) tkáně. Bezprostředně po elektrické stimulaci ani po jednom dni nedošlo v tkáních k expresi zánětu ani apoptóze, což potvrzuje, že elektrická stimulace způsobuje pouze bolest a nevyvolává poškození tkání.
3.3. Tlakový dolorimetr
Pravá zadní tlapka potkana byla ošetřena karagenanem k vyvolání zánětu a zadní tlapka byla vyfotografována z horního a bočního pohledu, jak je znázorněno na obrázku 5. Na obrázku 5 je vidět, že pravá zadní tlapka byla ošetřena karagenanem. Jedna skupina nebyla ošetřena karagenanem jako kontrola a druhá byla ošetřena fyziologickým roztokem jako negativní kontrola (obrázek 5 a)). 1% karagenan byl podáván v různých množstvích 100 μl, 150 μl a 200 μl. U všech zadních tlapek ošetřených karagenanem byly pozorovány zánětlivé příznaky edému a zarudnutí, zatímco kontrolní skupina a skupina ošetřená fyziologickým roztokem nevykazovaly žádné příznaky. Zánětlivý účinek karagenanu byl jasně odhalen barvením H&E. Jak ukazuje obrázek 5b), kontrolní skupina a skupina ošetřená fyziologickým roztokem vykazovaly zdravý stav tkání. Ve všech skupinách ošetřených karagenanem však bylo pozorováno nahromadění infiltrovaných zánětlivých buněk, jak ukazují šipky. Na pravém obrázku je pravá zadní tlapka potkana použitého pro kontrolní skupinu, skupinu s fyziologickým roztokem a skupinu s karagenanem a na levém obrázku je levá zadní tlapka potkana na obrázku 5(b).
Během průběhu zánětu byl změřen objem i velikost (šířka × výška) zadní tlapky pomocí pletyzmometrie a kaliperů. Měření bylo prováděno bezprostředně po injekci fyziologického roztoku a karagenanu a poté pokračovalo po dobu osmi hodin. U všech skupin ošetřených karagenanem se objem i velikost zadních tlapek postupně zvětšovaly s časem až do 6 h; s dalším prodlužováním času se však edém zmenšoval (obr. 6 a) a 6 b)). Kontrolní skupiny a skupiny ošetřené fyziologickým roztokem nevykazovaly žádné změny objemu a velikosti. Po změření edému (obrázky 6(a) a 6(b)) na základě koncentrace injekce karagenanu jsme potvrdili aspekt působení (tlaku) potkana v maximálním stavu edému 6 h po injekci karagenanu (obrázek 6(c)). Toto měření bylo provedeno za účelem shromáždění řady informací o klinickém stavu zánětu. U kontrolní skupiny a skupiny s fyziologickým roztokem nevykazovaly výsledky tlakového testu žádné významné změny. Ve skupině s edémem tlap vyvolaným karagenanem jsme byli schopni rozlišit rozdíly v hodnotách tlaku v závislosti na pozorovaném zánětu. Tyto výsledky naznačují, že jsme mohli určit stupeň bolesti podle různých úrovní zánětu. V této studii byl karagenan použit k hodnocení akutního zánětu; hodnocení chronického zánětu bude hodnoceno pomocí Complete Freund’s Adjuvant.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Závěry
Vyvinuli jsme systém měření bolesti pro objektivní a kvantitativní hodnocení bolesti. Pro křížovou validaci se systém skládal z elektrické stimulace i tlakové složky. Před použitím tohoto systému v klinickém prostředí byla na zvířecím modelu potvrzena bezpečnost a spolehlivost systému. Elektrická stimulace nezpůsobila žádné poškození, včetně zánětu tkáně a apoptózy. Při tlakovém testu závisely naměřené hodnoty tlaku na stupni zánětu. Náš systém měření bolesti vyžaduje krátkou dobu měření a při aplikaci na tkáň potkana nevyvolal zánět. V současné době je náš výzkum a vývoj dokončen a připraven ke komercializaci. Nejčastěji používanou částí bude nociceptivní bolest. Používá se na oddělení rehabilitační medicíny a v budoucnu se uplatní i neurochirurgická bolest (neuropatická bolest). Přestože zůstává mnoho výzev, může tento systém měření bolesti poskytnout zajímavé možnosti pro diagnostiku a léčbu různých onemocnění.
Konflikty zájmů
Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.
Poděkování
Tento výzkum byl podpořen programem „Software Convergence Technology Development Program“ prostřednictvím Ministerstva vědy, informačních a komunikačních technologií a plánování budoucnosti (ITAS0177160110290001000200200) a Ministerstvem obchodu, průmyslu a energetiky (MOTIE), Korea, prostřednictvím vzdělávacího programu pro tvůrčí a průmyslovou konvergenci (Grant no. N0000717) a grantu National Research Foundation of Korea (NRF) financovaného Ministerstvem školství, vědy a technologií korejské vlády (č. 2011-0030072).
Doplňkové materiály
Doplňkové údaje související s tímto článkem naleznete v online verzi. Obrázek S1: ruční tlakový dolorimetr se snímačem tlaku a součástmi displeje. Obrázek S2: obrázek zobrazující časový průběh edému tlapky vyvolaného karagenanem po injekci o objemu 100 μl. Obrázek S3: obrázek znázorňující časový průběh edému tlapky vyvolaného karagenanem po injekci 150 μl. Obrázek S4: obrázek znázorňující časový průběh edému tlapky vyvolaného karagenanem po injekci o objemu 200 μl. (Doplňkové materiály)