Abstract
Forståelse og præcis vurdering af smerteniveauet er nøglefaktorer i rehabiliteringsbehandling. Smerte er en kompleks og subjektiv oplevelse, der påvirkes af den enkeltes følelser og helbredstilstand. Der er blevet udviklet forskellige metoder til kvantitativ vurdering af smerteniveauet; disse metoder har imidlertid flere ulemper. I dette arbejde har vi udviklet et smertemåleapparat til kvantitativ smertevurdering. Systemet består af to dele, en komponent til elektrisk stimulation og et trykdolorimeter til påføring af to forskellige belastninger. Med hensyn til elektrisk stimulering vurderes graden af smerte ved hjælp af den anvendte strøm. Hudmodstanden blev også analyseret ved at anvende strøm for at fjerne de virkninger, der skyldes hudforhold. Den elektriske stimulering forårsagede ingen histologiske ændringer eller betændelse i vævene. Ved hjælp af trykdolorimeteret blev smerteniveauet vurderet i forhold til graden af inflammation. Dette system kan anvendes til kvantitativ vurdering af smerte forårsaget af betændelse, sår og andre faktorer. Da det beskrevne system er det første af sin art, er der stadig mange problemer, der mangler at blive løst. Med fortsat udvikling vil vores system imidlertid kunne give en mere præcis smertevurdering ved at fjerne hudtilstandseffekter og gennem krydsvalidering.
1. Indledning
Vurdering af en patients smerteskala er et vigtigt spørgsmål under rehabilitering. Imidlertid er smertemåling vanskelig, fordi det er en kompleks fornemmelse, der er forbundet med personlige egenskaber og erfaring . Der er blevet udviklet forskellige metoder til at vurdere smerteskalaen, herunder Visual Analog Scale (VAS), Numerical Rating Scale (NRS), Verbal Rating Scale (VRS), FACES Pain Rating Scale (FPRS) og McGill Pain Questionnaire (MPQ) . Blandt dem er VAS og FPRS hovedsagelig blevet anvendt i kliniske sammenhænge . VAS er udformet som en lige linje med en fast længde på 10 centimeter. Enderne er defineret som de yderste grænser for den parameter, der skal måles, og er orienteret fra “ingen smerte” til “den værst tænkelige smerte”. Patienterne markerer på den linje, der svarer til den smerteintensitet, de oplever i øjeblikket. I NRS får patienterne besked på at vælge et tal fra 0 til 10, som bedst beskriver deres aktuelle smerteintensitet. 0 betyder “ingen smerte”, og 10 betyder “værst tænkelige smerte”. VRS er en metode til smertevurdering, der udtrykkes med ord i stedet for tal. Patienterne vælger en sætning som f.eks. ingen smerte, moderat smerte, alvorlig smerte, meget alvorlig smerte og værst mulige smerte for at beskrive deres smertefornemmelse. FPRS er en smerteskala med seks punkter med seks forskellige ansigter, der repræsenterer stigende smerteniveauer. Patienterne bliver bedt om at vælge det udtryk, der bedst karakteriserer smerteintensiteten, fra “ingen smerte” til “alvorlig smerte”. Alle disse metoder er subjektive og afhænger af personlige erfaringer og følelser. Derfor er der betydelige individuelle variationer i vurderet smerte, hvilket resulterer i vanskelig kvantitativ vurdering.
For nylig blev der introduceret en kvantitativ smertevurderingsmetode ved hjælp af elektrisk stimulation . PainVision™-apparater måler perceptionstærsklen og den smerte, der produceres af en elektrisk strøm. Dette system kvantificerer smerteintensiteten ved at sammenligne den oplevede smerte med intensiteten af de elektriske opfattelser. Opfattelsestærsklen angiver den minimale elektriske strøm, som den enkelte føler, og den producerede smerte er defineret som den maksimale elektriske strøm, som den enkelte føler. En persons hudmodstand kan dog påvirke resultatet af den elektriske måling .
De vigtigste faktorer i forbindelse med udviklingen af et smertemåleapparat er objektivitet, nøjagtighed og kvantitativ vurdering. PainVision er et system, der gør det muligt for patienter at foretage målinger uanset hudmodstand. Hudmodstanden varierer alt efter patientens tilstand og omgivelser. Det er vanskeligt at forklare sammenhængen med tidligere målinger, hvis smerten måles under negligering af hudmodstanden. Men vores system måler ud fra patientens hudmodstand, før smerten måles.
Når patientens baselineværdi for hudmodstand er fastlagt, måles smerten. Det vil sige, at hudmodstandsværdien er en standard. Når referenceværdien er udarbejdet, bliver en beskrivelse af korrelationen mellem smerteværdierne målt før og efter smertemåling mulig.
I dette arbejde har vi udviklet et smertemåleapparat, der har to analysemetoder, elektrisk stimulering og påføring af tryk, til en mere præcis krydsvalidationsvurdering. Under elektrisk stimulering påføres elektrisk stress på et sted uden smerte, og derefter kan den observerede stress sammenlignes med smerte. De elektrisk stressede væv blev undersøgt histologisk for at identificere, om den elektriske stimulering forårsagede vævsskader. Under trykvurderingen blev smerten vurderet ved at lægge et tryk på smerteområdet. Der blev fremkaldt betændelse på rotternes bagpoter ved hjælp af carrageenan, og derefter blev den betændte bagpote stimuleret med en trykstimulator af håndtypen. Trykstedet blev derefter sammenlignet med betændelsesniveauerne.
2. Materiale og metoder
2.1. Princippet og komponenterne i smertemåleapparatet
Smertemåleapparatet blev udviklet til kvantitativ smerteanalyse. Anordningen består af to hoveddele, herunder en komponent til elektrisk stimulation og et trykdolorimeter, som vist i figur 1. Stimulering kunne påføres individet separat enten elektrisk eller via tryk. Ved at sammenligne reaktionen på elektrisk stimulering og tryk kunne vi opnå mere præcise resultater. Under elektrisk stimulering erstattes den smerte, som patienterne oplever, med elektrisk stimulering, dvs. at den påførte strømværdi omregnes til en oplevet eller oplevet smerteværdi. Ved at evaluere den elektriske stimulering og hudmodstanden på samme tid forventer vi også at kunne evaluere smerte objektivt på trods af varierende forhold som f.eks. ændringer i hud og krop, vejr- eller miljøforhold. Ved brug af trykdolorimeteret påføres trykket direkte på smerteområdet, og smerteudbruddet måles ved hjælp af trykmængden.
Smertemåleapparatet anvender fem knapper, herunder strøm, ES (elektrisk stimulation), PS (trykstimulation), EB (nødknap) og SS (stopknap). ES og PS anvendes til at anvende elektrisk stimulering og trykstimulering på den enkelte. EB er en strømudkoblingsknap, der er tilgængelig i nødstilfælde, og SS er en knap, der anvendes ved afslutningen af smertemålingerne. Den elektriske stimuleringskomponent var forbundet med to elektroder til måling af den opfattede strøm (50 Hz, pulsbredde 0,3 ms) og smertetærsklen. De to elektroder anbringes på et fladt sted, f.eks. på et dyrs flanke eller på menneskets mediale underarm. Det elektriske stimuleringssystem giver samme stimuleringsniveau og stimulusintensitet som smerte; Ad-fiberen leder primært smertesignalet (elektrisk signal). Trykdolorimeteret er forbundet med en tryksensor af spidstypen i en håndstimulator. Der blev trykket på stopkontakten, når deltageren følte smerte.
2.2. Forberedelse af dyremodel
Voksne han Sprague-Dawley rotter (Raon Bio. Inc., Yongin, Korea) på 250-350 g og 49-56 dage gamle blev holdt under en 12 timers lys/12 timers mørkecyklus (lys kl. 06:00) ved 24 ± 0,5 °C i et centralt dyreplejeanlæg. Vand og rottefoder blev leveret ad libitum, indtil forsøgene begyndte. Alle dyreforsøg blev godkendt af Komitéen for dyreforsøg i College of Medicine, Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-084), og blev behandlet i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
2.3. Histologisk undersøgelse
Råtter blev enten stimuleret elektrisk eller behandlet med carrageenan for at fremkalde smerte. De inflammatoriske reaktioner, der blev induceret ved de to forskellige behandlinger, blev sammenlignet ved histologisk vurdering. Rotter blev perfunderet intracardialt med kold PBS indeholdende heparin (0,2 U/ml) og 4% paraformaldehyd og derefter oplagret i 4% paraformaldehyd. Det stressede væv som følge af elektrisk stimulering og carrageenan-stimulering blev halveret og anbragt i indlejringskassetter. Hver prøve blev indlejret i paraffinvoks og derefter skåret i 5 μm tykke prøver ved hjælp af et roterende mikrotom (HM340E, Microm, Walldorf, Tyskland). Den snittede prøve blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) og derefter analyseret under et Nikon inverteret forskningsmikroskop Ti-E og et Nikon Ds-Ri1 digitalkamera styret af Nis-Elements (Br)-software (Nikon Inc., Kawasaki, Japan).
2.4. Immunofluorescensfarvning
Effekterne af elektrisk stimulering på inflammation og apoptose i vævene blev undersøgt ved hjælp af immunofluorescens. Det elektrisk stimulerede flankevæv fra rotter blev indlejret i paraffin og skåret i 4 μm tykke prøver. Til antigenudtagning blev vævsafsnittene opvarmet i TRS-buffer i ca. 10 minutter og derefter vasket med destilleret vand tre gange. Prøverne blev behandlet med 0,03 % H2O2 for at hæmme den endogene peroxidaseaktivitet og derefter vasket med PBS-opløsning. Derefter blev prøverne permeabiliseret med 0,5 % Triton X-100 i PBS i ti minutter ved stuetemperatur og blokeret med 5 % gedeserumalbumin og 1 % bovin serumalbumin i PBS i en time. Prøverne blev vasket med PBS to gange i ti minutter hver. Prøverne blev inkuberet natten over ved 4 °C med et primært antistof, enten COX2 (fortyndet 1 : 1000) eller caspase-3 (fortyndet 1 : 1000), fortyndet i 1 % bovin serumalbumin i PBS. Prøverne blev vasket fire gange med PBS og derefter inkuberet i kronologisk rækkefølge med sekundært antistof (mus og kanin, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) fortyndet i 1 % BSA i PBS ved stuetemperatur og i mørke i to timer. Endelig blev prøverne vasket to gange med PBS i to minutter og derefter dækket med DAPI-holdigt monteringsmedium. Billeder blev optaget ved hjælp af et Zeiss Axiovert-mikroskop (Zeiss, Tyskland) og Axiovision Rel. 4.5 Analysis System (Zeiss, Tyskland).
3. Resultater og diskussion
3.1. Smertemåleskema
For elektrisk stimulering blev rotterne bedøvet via intraperitoneal injektion med chloralhydrat (300 mg/kg), og rotternes hår blev fjernet. EKG-elektroden blev fastgjort til højre flanke af rotten med henblik på elektrisk stimulering, som vist i figur 2(a). Den elektriske stimulering blev påført rottens venstre flanke. Den anvendte spænding blev gradvist øget fra 0 til 50 V. Strømværdien målt hos hver rotte varierede fra 12,5 til 92 μA, som vist i figur 2(b). Rottens reaktionsadfærd blev ikke observeret, fordi den elektriske stimulering blev udført under bedøvelse. Vi forventer imidlertid, at stimulering altid kan måles uanset den fysiske tilstand eller hudtilstanden ved at identificere spænding, strøm og modstand relateret til rottefysiologiske faktorer.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
I trykdolorimeterprøven blev rotten anbragt i et fastholdelseskammer uden bedøvelse, som vist i figur 2(c). Inflammation blev fremkaldt ved indsprøjtning af carrageenan i højre bagpote. Carrageenan blev anvendt til at bekræfte nociceptiv smerte. Det udstyr, vi byggede, blev også fremstillet til at identificere den nociceptive smerte først. Inflammationsniveauet blev kontrolleret af mængden af carrageenan, som blev øget fra 100 til 200 μl af en 1 % (w/v) opløsning. 100 μl saltvandsopløsning blev injiceret på den intraplantar region af venstre bagpote som kontrol. Den betændte højre bagpote blev stimuleret ved hjælp af en trykstimulator af håndtypen, som vist i figur S1. Rotten reagerede på trykstimuleringen. Vores hypotese er, at tærsklen for trykresponsen hos rotten afhænger af graden af inflammation. Inflammationsudtrykket i rottens bagpote efterligner sygdomsniveauet i klinisk praksis. Stigninger i bagpodens volumen og størrelse i henhold til inflammation blev målt på hvert tidspunkt efter carrageenaninjektionen. Volumenet af bagpoterne blev målt ved hjælp af plethysmometri (model 7140 plethysmometer, Ugo Basile, Italien), og der blev anvendt en målekaliber (model CD-6P; Mitutoyo, Tokyo, Japan) til at måle bredden og tykkelsen af poterne på hver enkelt rotte. Trykstimuleringen blev påført, når betændelsesudtrykket nåede sit maksimum. Rottens reaktion blev observeret ved at øge trykniveauet, og tryktærsklen blev sammenlignet med betændelsesgraden.
3.2. Elektrisk stimulering
For at verificere, at den anvendte elektriske stimulering kun inducerede smerte uden at skade rotten, blev det stimulerede væv undersøgt med hensyn til histologi og inflammation. Figur 3 viser de makroskopiske billeder af H&E-farvede væv, der blev elektrisk stimuleret ved stigende spænding fra 0 til 50 V. Den ene gruppe af vævene blev farvet umiddelbart efter den elektriske stimulering (venstre kolonne), og den anden blev farvet et døgn efter stimuleringen (højre kolonne).
Kontrolgruppen viste normalt flankvæv. Der blev ikke observeret nogen forskelle i de elektrisk stressede væv i forhold til kontrolvævet, selv om spændingen steg til 50 V. Der blev ikke observeret nogen abnormiteter 24 timer efter elektrisk stimulering. Både inflammatoriske og apoptotiske virkninger af den elektriske stimulering blev undersøgt ved dobbelt immunofluorescensfarvning for caspase-3 og COX-2. Figur 4 viser resultaterne af dobbelt immunofluorescensfarvning for normalt (ikke-stimuleret) og stimuleret (ved 10 og 50 V) væv. Der var ingen betændelsesudtryk eller apoptose i vævene umiddelbart efter elektrisk stimulering eller efter et døgn, hvilket bekræfter, at elektrisk stimulering kun forårsagede smerte og ikke forårsagede vævsskader.
3.3. Trykdolorimeter
Rattens højre bagpote blev behandlet med carrageenan for at fremkalde betændelse, og bagpoten blev fotograferet fra top- og sidevinkel, som vist i figur 5. Den ene gruppe blev ikke behandlet med carrageenan som kontrol, og den anden blev behandlet med saltvand som negativ kontrol (figur 5(a)). 1 % carrageenan blev injiceret i varierende mængder på 100 μl, 150 μl og 200 μl. Der blev observeret inflammatoriske symptomer i form af ødemer og rødme i alle bagpoter behandlet med carrageenan, mens kontrol- og saltvandsbehandlede grupper ikke viste nogen symptomer. Den inflammatoriske virkning af carrageenan blev tydeligt afsløret ved H&E-farvning. Som vist i figur 5(b) viste de kontrol- og saltvandsbehandlede grupper en sund vævstilstand. Der blev imidlertid observeret en ophobning af infiltrerede inflammatoriske celler i alle carrageenan-behandlede grupper, som angivet med pile. Det højre billede er en højre bagpote af en rotte anvendt til kontrol, saltvand og carrageenan, og det venstre billede er en venstre bagpote af rotten i figur 5(b).
Under betændelsesforløbet blev både volumen og størrelse (bredde × højde) af bagpoterne målt ved hjælp af plethysmometri og kalibrer. Målingen blev foretaget umiddelbart efter saltvands- og carrageenaninjektionen og fortsatte derefter i otte timer. I alle carrageenan-behandlede grupper steg både volumen og størrelse af bagpoterne gradvist med tiden op til 6 timer; ødemet aftog dog med yderligere stigende tid (figur 6(a) og 6(b)). Kontrol- og saltvandsbehandlede grupper viste ingen ændringer i volumen og størrelse. Efter måling af ødem (figur 6(a) og 6(b)) baseret på carrageenaninjektionskoncentrationen bekræftede vi rotternes virkningsaspekt (tryk) i den maksimale ødemtilstand 6 h efter carrageenaninjektion (figur 6(c)). Denne måling blev udført for at indsamle en række oplysninger om den kliniske betændelsestilstand. I kontrol- og saltvandsgrupperne viste resultaterne af trykprøvningen ingen signifikante ændringer. I gruppen med carrageenaninduceret poteødem var vi i stand til at skelne forskelle i trykværdierne afhængigt af den observerede inflammation. Disse resultater viser, at vi kunne bestemme graden af smerte i henhold til forskellige inflammationsniveauer. I denne undersøgelse blev carrageenan anvendt til at vurdere akut inflammation; vurdering af kronisk inflammation vil blive vurderet ved hjælp af Complete Freund’s Adjuvant.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Konklusioner
Vi har udviklet et smertemålesystem til objektiv og kvantitativ smertevurdering. Til krydsvalidering bestod systemet af både elektriske stimulerings- og trykkomponenter. Før dette system blev anvendt i en klinisk sammenhæng, blev systemets sikkerhed og pålidelighed bekræftet ved hjælp af en dyremodel. Den elektriske stimulering forårsagede ingen skader, herunder vævsbetændelse og apoptose. I trykprøven var de målte trykværdier afhængige af graden af inflammation. Vores smertemålingssystem kræver en kort måletid og fremkaldte ikke inflammation, når det blev anvendt på rottevæv. På nuværende tidspunkt er vores forskning og udvikling afsluttet og klar til kommercialisering. Den mest almindeligt anvendte del vil være nociceptive smerter. Det anvendes i rehabiliteringsmedicinsk afdeling, og neurokirurgisk smerte (neuropatiske smerter) vil blive anvendt i fremtiden. Selv om der fortsat er mange udfordringer, kan dette smertemålesystem give spændende muligheder for diagnosticering og behandling af forskellige sygdomme.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Anerkendelser
Denne forskning blev støttet af “Software Convergence Technology Development Program” gennem ministeriet for videnskab, IKT og fremtidsplanlægning (ITAS017716010110290001000200200) og ministeriet for handel, industri og energi (MOTIE), Korea, gennem uddannelsesprogrammet for kreativ og industriel konvergens (Grant no. N0000717) og National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regerings ministerium for uddannelse, videnskab og teknologi (nr. 2011-0030072).
Supplementary Materials
Supplementary data associated with this article can be found in the online version. Figur S1: Trykdolorimeteret af håndtypen med tryksensor og displaykomponenter. Figur S2: et billede, der viser tidsforløbet af carrageenaninduceret poteødem efter en 100 μl injektionsmængde. Figur S3: et billede, der viser tidsforløbet af carrageenaninduceret poteødem efter en 150 μl injektionsmængde. Figur S4: et billede, der viser tidsforløbet af carrageenaninduceret poteødem efter en 200 μl injektionsmængde. (Supplerende materialer)