Abstract
Zrozumienie i precyzyjna ocena poziomu bólu są kluczowymi czynnikami w terapii rehabilitacyjnej. Ból jest złożonym i subiektywnym doświadczeniem, na które mają wpływ indywidualne emocje i stan zdrowia. Opracowano wiele metod ilościowej oceny poziomu bólu, jednakże metody te mają kilka wad. W niniejszej pracy opracowaliśmy urządzenie do ilościowej oceny bólu. System składa się z dwóch części, komponentu do stymulacji elektrycznej i dolorymetru ciśnieniowego, do stosowania dwóch różnych obciążeń. Jeśli chodzi o stymulację elektryczną, stopień odczuwania bólu jest oceniany na podstawie przyłożonego prądu. Oporność skóry była również analizowana poprzez zastosowanie prądu w celu usunięcia efektów spowodowanych warunkami skórnymi. Stymulacja elektryczna nie wywołała żadnych zmian histologicznych ani stanów zapalnych w tkankach. Używając dolorymetru ciśnieniowego, poziom bólu był oceniany w zależności od stopnia zapalenia. System ten może być wykorzystany do ilościowej oceny bólu wywołanego stanem zapalnym, ranami i innymi czynnikami. Ponieważ opisany system jest pierwszym tego rodzaju, istnieje wiele problemów, które pozostają do rozwiązania. Jednakże, przy ciągłym rozwoju, nasz system może zapewnić dokładniejszą ocenę bólu poprzez usunięcie efektów stanu skóry oraz poprzez walidację krzyżową.
1. Wprowadzenie
Ocena skali bólu u pacjenta jest ważnym zagadnieniem podczas rehabilitacji. Pomiar bólu jest jednak trudny, ponieważ jest to odczucie złożone, związane z cechami osobniczymi i doświadczeniem. Do oceny skali bólu opracowano różne metody, w tym Visual Analog Scale (VAS), Numerical Rating Scale (NRS), Verbal Rating Scale (VRS), FACES Pain Rating Scale (FPRS) i McGill Pain Questionnaire (MPQ). Spośród nich, VAS i FPRS były głównie używane w warunkach klinicznych. VAS jest zaprojektowana jako linia prosta o stałej długości 10 centymetrów. Jej końce są zdefiniowane jako skrajne granice mierzonego parametru, zorientowane od „braku bólu” do „najgorszego wyobrażalnego bólu”. Pacjenci zaznaczają na linii odpowiadającej natężeniu bólu, którego aktualnie doświadczają. NRS instruuje pacjentów, aby wybrali liczbę od 0 do 10, która najlepiej opisuje ich aktualne natężenie bólu. 0 oznacza „brak bólu”, a 10 oznacza „najgorszy możliwy ból”. VRS jest metodą oceny bólu, która jest wyrażona za pomocą słów, a nie liczb. Pacjenci wybierają zdania takie jak: brak bólu, umiarkowany ból, silny ból, bardzo silny ból i najgorszy możliwy ból, aby opisać swoje odczucia bólowe. FPRS jest sześciopunktową skalą bólu z sześcioma różnymi twarzami, które reprezentują rosnący poziom bólu. Pacjenci proszeni są o wybranie wyrazu, który najlepiej charakteryzuje natężenie bólu, od „brak bólu” do „silny ból”. Wszystkie te metody są subiektywne i zależą od osobistych doświadczeń i emocji. Dlatego istnieją znaczne indywidualne różnice w ocenie bólu, które utrudniają ocenę ilościową.
Ostatnio wprowadzono ilościową metodę oceny bólu z wykorzystaniem stymulacji elektrycznej. Urządzenia PainVision™ mierzą próg percepcji i ból wytwarzany przez prąd elektryczny. System ten określa ilościowo intensywność bólu poprzez porównanie odczuwanego bólu z intensywnością percepcji elektrycznej. Próg percepcji wskazuje minimalną wartość prądu elektrycznego odczuwanego przez daną osobę, a odczuwany ból jest definiowany jako maksymalna wartość prądu elektrycznego odczuwanego przez daną osobę. Jednakże, oporność skóry danej osoby może wpływać na wynik pomiaru elektrycznego.
Najważniejszymi czynnikami w rozwoju urządzenia do pomiaru bólu są obiektywność, dokładność i ocena ilościowa. PainVision jest systemem, który umożliwia pacjentom dokonywanie pomiarów niezależnie od oporności skóry. Opór skóry zmienia się w zależności od stanu i środowiska pacjenta. Trudno jest wyjaśnić korelację z poprzednimi pomiarami, jeśli ból jest mierzony z pominięciem oporu skóry. Jednak nasz system mierzy opór skóry pacjenta przed pomiarem bólu.
Po określeniu podstawowej wartości oporu skóry pacjenta, mierzony jest ból. Oznacza to, że wartość oporu skóry jest wzorcem. Kiedy wartość odniesienia jest przygotowana, możliwy staje się opis korelacji wartości bólu mierzonych przed i po pomiarze bólu.
W tej pracy opracowaliśmy urządzenie do pomiaru bólu, które posiada dwie metody analizy, stymulację elektryczną i wywieranie nacisku, w celu dokładniejszej oceny walidacji krzyżowej. Podczas stymulacji elektrycznej, naprężenie elektryczne jest stosowane w miejscu nie powodującym bólu, a następnie obserwowane naprężenie może być porównane z bólem. Tkanki poddane naprężeniu elektrycznemu były badane histologicznie w celu określenia, czy stymulacja elektryczna spowodowała uszkodzenie tkanek. Podczas oceny nacisku, ból był oceniany poprzez zastosowanie nacisku na miejsce bólu. Zapalenie zostało wywołane na tylnej łapie szczura za pomocą karagenu, a następnie zapalnie zmieniona tylna łapa była stymulowana przez ręczny stymulator ciśnienia. Miejsce ucisku było następnie porównywane z poziomem zapalenia.
2. Materiał i Metody
2.1. Zasada działania i komponenty urządzenia do pomiaru bólu
Urządzenie do pomiaru bólu zostało opracowane do ilościowej analizy bólu. Urządzenie składa się z dwóch głównych części, w tym komponentu do stymulacji elektrycznej i dolorymetru ciśnieniowego, jak pokazano na Rysunku 1. Stymulacja może być oddzielnie zastosowana do osoby albo elektrycznie albo poprzez nacisk. Porównując reakcję na stymulację elektryczną i ucisk, moglibyśmy uzyskać dokładniejsze wyniki. Podczas stymulacji elektrycznej, ból doświadczany przez pacjentów jest zastępowany stymulacją elektryczną; mianowicie, wartość przyłożonego prądu jest przekładana na wartość doświadczanego lub odczuwanego bólu. Ponadto, oceniając stymulację elektryczną i opór skóry w tym samym czasie, oczekujemy obiektywnej oceny bólu pomimo zmiennych warunków, takich jak zmiany w skórze i ciele, pogoda lub warunki środowiskowe. Podczas używania dolorymetru ciśnieniowego, nacisk jest stosowany bezpośrednio na miejsce bólu i początek bólu jest mierzony przez siłę nacisku.
Urządzenie do pomiaru bólu wykorzystuje pięć przycisków, w tym przycisk zasilania, ES (stymulacja elektryczna), PS (stymulacja ciśnieniowa), EB (przycisk awaryjny) i SS (wyłącznik awaryjny). ES i PS są wykorzystywane do stosowania stymulacji elektrycznej i ciśnieniowej u pacjenta. EB jest przyciskiem wyłączającym zasilanie, dostępnym w sytuacjach awaryjnych, a SS jest przyciskiem używanym po zakończeniu pomiarów bólu. Komponent stymulacji elektrycznej został połączony z dwoma elektrodami do pomiaru prądu postrzeganego (50 Hz, szerokość impulsu 0.3 ms) i progu bólu. Dwie elektrody zostały umieszczone na płaskim miejscu, takim jak bok zwierzęcia lub przyśrodkowe przedramię człowieka. System stymulacji elektrycznej zapewnia taki sam poziom stymulacji i intensywność bodźców jak ból; włókno Ad przewodzi przede wszystkim sygnał bólowy (sygnał elektryczny). Dolorymetr ciśnienia jest podłączony do czujnika ciśnienia typu końcówka stymulatora ręki. Przełącznik stop był wciskany, gdy uczestnik odczuwał ból.
2.2. Przygotowanie modelu zwierzęcego
Dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (Raon Bio. Inc., Yongin, Korea) o wadze 250-350 g i wieku 49-56 dni były trzymane w cyklu 12 h światła/12 h ciemności (światła o 06:00 h) w temperaturze 24 ± 0,5°C w centralnym ośrodku opieki nad zwierzętami. Woda i karma dla szczurów były podawane ad libitum do momentu rozpoczęcia eksperymentów. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach w College of Medicine, Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-084), i były traktowane zgodnie z National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
2.3. Badanie histologiczne
Szczury były albo stymulowane elektrycznie albo traktowane karagenem w celu wywołania bólu. Reakcje zapalne wywołane przez dwa różne zabiegi były porównywane przez ocenę histologiczną. Szczury perfundowano wewnątrzsercowo zimnym PBS zawierającym heparynę (0,2 U/ml) i 4% paraformaldehyd, a następnie umieszczano w 4% paraformaldehydzie. Zestresowane tkanki powstałe w wyniku stymulacji elektrycznej i karagenowej były dzielone na części i umieszczane w kasetach do zatapiania. Każda próbka była zatapiana w parafinie, a następnie sekcjonowana na próbki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego (HM340E, Microm, Walldorf, Niemcy). Wyciętą próbkę barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie analizowano w odwróconym mikroskopie badawczym Nikon Ti-E i aparacie cyfrowym Nikon Ds-Ri1 kontrolowanym przez oprogramowanie Nis-Elements (Br) (Nikon Inc., Kawasaki, Japonia).
2.4. Immunofluorescence Staining
Wpływ stymulacji elektrycznej na stan zapalny i apoptozę tkanek badano metodą immunofluorescencji. Stymulowana elektrycznie tkanka boczku szczurów została zatopiona w parafinie i podzielona na próbki o grubości 4 μm. W celu odzyskania antygenu, fragmenty tkanek ogrzewano w buforze TRS przez około dziesięć minut, a następnie trzykrotnie przemywano wodą destylowaną. Próbki poddawano działaniu 0,03% H2O2 w celu zahamowania aktywności endogennej peroksydazy, a następnie przemywano roztworem PBS. Następnie próbki były permeabilizowane 0,5% Tritonem X-100 w PBS przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej i blokowane 5% kozią i 1% surowiczą albuminą bydlęcą w PBS przez jedną godzinę. Próbki przemywano PBS dwukrotnie przez dziesięć minut każda. Próbki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałem pierwotnym, COX2 (rozcieńczonym w stosunku 1 : 1000) lub kaspazą-3 (rozcieńczonym w stosunku 1 : 1000), rozcieńczonym w 1% albuminie surowicy bydlęcej w PBS. Próbki przemywano czterokrotnie PBS, a następnie inkubowano w kolejności chronologicznej z przeciwciałem drugorzędowym (mysz i królik, Alexa Fluor 2nd ab, 1 : 500) rozcieńczonym w 1% BSA w PBS w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie godziny. Na koniec próbki były dwukrotnie płukane PBS przez dwie minuty, a następnie pokrywane medium montażowym zawierającym DAPI. Obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axiovert (Zeiss, Niemcy) i systemu analitycznego Axiovision Rel. 4.5 (Zeiss, Niemcy).
3. Wyniki i Dyskusja
3.1. Schemat pomiaru bólu
Do stymulacji elektrycznej szczury były znieczulane poprzez iniekcję dootrzewnową z użyciem wodzianu chloralu (300 mg/kg), a włosy szczura były usuwane. Elektroda EKG została przymocowana do prawego boku szczura w celu stymulacji elektrycznej, jak pokazano na Rysunku 2(a). Stymulację elektryczną zastosowano na lewym boku szczura. Przyłożone napięcie było stopniowo zwiększane od 0 do 50 V. Wartość prądu mierzona u każdego szczura wahała się od 12,5 do 92 μA, jak pokazano na Rysunku 2(b). Nie zaobserwowano reakcji szczurów, ponieważ stymulacja elektryczna była prowadzona w znieczuleniu. Oczekujemy jednak, że stymulacja może być zawsze mierzona niezależnie od stanu fizycznego lub skóry poprzez identyfikację napięcia, prądu i oporu związanego z czynnikami fizjologicznymi szczura.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
W teście dolorymetru ciśnieniowego, szczur został umieszczony w komorze krępującej bez znieczulenia, jak pokazano na Rysunku 2(c). Zapalenie zostało wywołane przez wstrzyknięcie karagenu w prawą tylną łapę. Karagen był używany do potwierdzenia bólu nocyceptywnego. Zbudowany przez nas sprzęt został również wykonany tak, aby najpierw zidentyfikować ból nocyceptywny. Poziomy zapalenia były kontrolowane przez ilość karagenu, który był zwiększany od 100 do 200 μl 1% (w/v) roztworu. 100 μl roztworu soli fizjologicznej wstrzyknięto w okolicę śródkostną lewej tylnej łapy jako kontrolę. Zapalona prawa tylna łapa była stymulowana przez ręczny stymulator ciśnienia, jak pokazano na Rysunku S1. Szczur zareagował na stymulację ciśnieniową. Naszą hipotezą jest, że próg odpowiedzi na ciśnienie u szczura zależy od stopnia zapalenia. Ekspresja stanu zapalnego w tylnej łapie szczura naśladuje poziomy choroby w praktyce klinicznej. Wzrost objętości i wielkości tylnej łapy w zależności od stanu zapalnego był mierzony w każdym punkcie czasowym po wstrzyknięciu karagenu. Objętość tylnych łap była mierzona pletyzmometrem (model 7140 pletyzmometr, Ugo Basile, Włochy), a suwmiarki (model CD-6P; Mitutoyo, Tokio, Japonia) były używane do pomiaru szerokości i grubości łap każdego szczura. Stymulacja uciskowa została zastosowana, gdy ekspresja stanu zapalnego osiągnęła maksimum. Reakcja szczurów była obserwowana poprzez zwiększanie poziomu ciśnienia, a próg ciśnienia był porównywany ze stopniem zapalenia.
3.2. Stymulacja elektryczna
W celu sprawdzenia, czy zastosowana stymulacja elektryczna wywołała jedynie ból bez uszkodzenia szczura, stymulowane tkanki zbadano pod względem histologicznym i stanu zapalnego. Rycina 3 przedstawia makroskopowe obrazy tkanek barwionych H&E, które były stymulowane elektrycznie poprzez zwiększanie napięcia od 0 do 50 V. Jedna grupa tkanek została wybarwiona bezpośrednio po stymulacji elektrycznej (lewa kolumna), a druga została wybarwiona jeden dzień po stymulacji (prawa kolumna).
W grupie kontrolnej stwierdzono prawidłową tkankę boczku. Nie zaobserwowano różnic w tkankach poddanych stresowi elektrycznemu w porównaniu z tkanką kontrolną, mimo że napięcie wzrosło do 50 V. Żadnych nieprawidłowości nie zaobserwowano 24 godziny po stymulacji elektrycznej. Zarówno zapalne, jak i apoptotyczne efekty stymulacji elektrycznej były badane przez podwójne barwienie immunofluorescencyjne dla kaspazy-3 i COX-2. Rycina 4 przedstawia wyniki podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego dla tkanek prawidłowych (niestymulowanych) i stymulowanych (pod napięciem 10 i 50 V). Nie stwierdzono ekspresji stanu zapalnego ani apoptozy w tkankach bezpośrednio po stymulacji elektrycznej ani po jednym dniu, co potwierdza, że stymulacja elektryczna powodowała jedynie ból i nie wywoływała uszkodzenia tkanek.
3.3. Dolorymetr ciśnieniowy
Prawą tylną łapę szczura potraktowano karagenem w celu wywołania stanu zapalnego, a tylną łapę sfotografowano z widoku górnego i bocznego, jak pokazano na rycinie 5. Jedna grupa nie była leczona karagenem jako kontrola, a druga była leczona solą fizjologiczną jako kontrola negatywna (Rysunek 5(a)). 1% karagen wstrzykiwano w zmiennych ilościach 100 μl, 150 μl i 200 μl. Objawy zapalne w postaci obrzęku i zaczerwienienia zaobserwowano we wszystkich tylnych łapach poddanych działaniu karagenu, podczas gdy w grupach kontrolnych i poddanych działaniu soli fizjologicznej nie zaobserwowano żadnych objawów. Efekt zapalny karagenu został wyraźnie ujawniony przez barwienie H&E. Jak pokazano na Rysunku 5(b), grupy kontrolna i leczona solą fizjologiczną wykazywały zdrowy stan tkanek. Jednakże, nagromadzenie nacieków komórek zapalnych zaobserwowano we wszystkich grupach poddanych działaniu karagenu, jak wskazano strzałkami. Prawy obraz to prawa tylna łapa szczura używana do kontroli, soli fizjologicznej i karagenu, a lewy obraz to lewa tylna łapa szczura z rysunku 5(b).
Podczas postępu zapalenia mierzono zarówno objętość, jak i rozmiar (szerokość × wysokość) tylnej łapy przy użyciu pletyzmometru i suwmiarki. Pomiar przeprowadzono natychmiast po wstrzyknięciu soli fizjologicznej i karagenu, a następnie kontynuowano przez osiem godzin. We wszystkich grupach, którym podawano karagen, zarówno objętość, jak i wielkość tylnej łapy stopniowo zwiększały się wraz z upływem czasu do 6 h; jednakże obrzęk zmniejszał się wraz z upływem czasu (ryc. 6(a) i 6(b)). W grupie kontrolnej i grupie, której podawano sól fizjologiczną, nie stwierdzono zmian w objętości i wielkości łap. Po zmierzeniu obrzęku (ryc. 6(a) i 6(b)) w zależności od stężenia wstrzykniętego karagenu, potwierdziliśmy aspekt działania (ciśnienie) szczura w maksymalnym stanie obrzęku 6 h po wstrzyknięciu karagenu (ryc. 6(c)). Pomiar ten został wykonany w celu zebrania różnych informacji na temat klinicznego stanu zapalnego. W grupach kontrolnej i z solą fizjologiczną wyniki testu ciśnieniowego nie wykazały istotnych zmian. W grupie z obrzękiem łapy wywołanym karagenem, byliśmy w stanie wyróżnić różnice w wartościach ciśnienia w zależności od obserwowanego stanu zapalnego. Wyniki te wskazują, że mogliśmy określić stopień bólu w zależności od różnych poziomów zapalenia. W tym badaniu, karagen był używany do oceny ostrego stanu zapalnego; ocena przewlekłego stanu zapalnego będzie oceniana przy użyciu Kompletnego Adiuwantu Freunda.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Wnioski
Opracowaliśmy system pomiaru bólu do obiektywnej i ilościowej oceny bólu. W celu walidacji krzyżowej system składał się zarówno z komponentów stymulacji elektrycznej, jak i ucisku. Przed zastosowaniem tego systemu w warunkach klinicznych, bezpieczeństwo i niezawodność systemu zostały potwierdzone przy użyciu modelu zwierzęcego. Stymulacja elektryczna nie spowodowała żadnych uszkodzeń, w tym zapalenia tkanek i apoptozy. W teście ciśnieniowym mierzone wartości ciśnienia zależały od stopnia zapalenia. Nasz system pomiaru bólu wymaga krótkiego czasu pomiaru i nie wywoływał stanu zapalnego podczas aplikacji na tkanki szczurów. Obecnie nasze prace badawczo-rozwojowe zostały zakończone i są gotowe do komercjalizacji. Najczęściej wykorzystywanym elementem będzie ból nocyceptywny. Jest on wykorzystywany na oddziale medycyny rehabilitacyjnej, a w przyszłości znajdzie zastosowanie w bólu neurochirurgicznym (neuropatycznym). Chociaż pozostaje wiele wyzwań, ten system pomiaru bólu może zapewnić ekscytujące możliwości w diagnostyce i leczeniu różnych chorób.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez „Software Convergence Technology Development Program,” przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (ITAS0177160110290001000200200) oraz Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE), Korea, przez Program Edukacyjny dla Twórczej i Przemysłowej Konwergencji (Grant no. N0000717) i National Research Foundation of Korea (NRF) grant ufundowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii rządu koreańskiego (nr 2011-0030072).
Materiały uzupełniające
Dane uzupełniające związane z tym artykułem można znaleźć w wersji online. Rysunek S1: ręczny dolorymetr ciśnienia z czujnikiem ciśnienia i elementami wyświetlacza. Rysunek S2: obraz przedstawiający przebieg czasowy obrzęku łapy wywołanego karagenem po wstrzyknięciu 100 μl. Figura S3: obraz przedstawiający przebieg czasowy obrzęku łapy wywołanego karagenem po wstrzyknięciu 150 μl. Figura S4: obraz przedstawiający przebieg czasowy obrzęku łapy wywołanego karagenem po wstrzyknięciu 200 μl. (Materiały uzupełniające)
.